青海大黄油菜黄籽基因SSR标记开发和图谱构建

赵会彦　肖麓　杜德志

摘要：青海大黄油菜是青藏高原特有的一个白菜型油菜地方品种，具有黄籽的优良性状。前人研究结果表明大黄油菜黄籽性状受一对隐性基因Brsc1控制。该基因被定位于白菜型油菜的A9染色体上。为了筛选更多与Brsc1紧密连锁的标记，本研究根据Brsc1所在染色体区间，依据BRAD数据库中已公布的白菜型油菜的序列信息（http：//brassicadb.org/brad/），设计新的SSR引物，同时利用同源区间内已有的SSR引物对目标基因进一步精细定位。以大黄油菜和褐籽油菜09A-126为亲本，构建BC1分离群体和F2群体，结合BSA法，对SSR引物进行检测，共筛选到5个与Brsc1基因紧密连锁的SSR标记：A-11-65、A-11-145、B-6-32、BrID10607和KS10760，其中A-11-65为共显性标记。构建了Brsc1的SSR标记遗传图谱和物理图谱，图谱标记密度较前人进一步增加。这些标记的获得为油菜黄籽品种分子标记辅助选择育种体系的建立和黄籽基因的克隆奠定了基础。

关键词：青海大黄油菜；黄籽基因；SSR；遗传图谱；物理图谱

中图分类号： S565.401文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0032-04

收稿日期：2013-05-04

基金项目：国家自然科学基金（编号：31060196）；国家“863”计划（编号：2011AA10A104）；国家“973”计划（编号：2012CB723007）；国家油菜产业技术体系专项（编号：CARS-13）。

作者简介：赵会彦（1989—），男，河南南阳人，硕士研究生，主要从事春油菜分子生物学研究。E-mail：13639767407@163.com。

通信作者：肖麓，博士。 E-mail：981919669@qq.com。油菜是世界范围内广泛种植的油料作物之一，也是我国食用植物油的重要来源。油菜种皮颜色有黄色、褐色、黑色等，研究结果表明，在相同遗传背景下，黄籽油菜与黑、褐籽等油菜相比，具有种皮薄，皮壳率低，蛋白质和含油量高，色素含量少等优点[1-2]。白菜型黄籽油菜为自然界存在的天然黄籽资源之一，对白菜型油菜黄籽基因进行定位，开发与黄籽基因紧密连锁的分子标记，构建黄籽基因的遗传连锁图谱和物理图谱，对黄籽油菜分子标记辅助选择育种体系的建立、黄籽基因的图位克隆以及转基因油菜品种的培育等都具有重要的意义[3-7]。Chen等利用印度黄籽沙逊构建白菜-芥蓝（B. campestris-B. alboglabra）C染色体组异附加系，并利用该异附加系筛选出一个与黄籽基因紧密连锁的RAPD标记B06-600[8]。Rahman等在白菜型黄籽沙逊油菜中发现1个与黄籽性状主效基因（Br1/br1）紧密连锁的SRAP标记SA7BG29-245，并将这个标记转化为共显性SNP（单核苷酸多态性）标记和SCAR（序列特异性扩增区域）标记[9]。Zhang等利用大白菜双单倍体群体进行黄籽基因的精细定位和图位克隆，用13个SRAP标记、6个SCAR标记和4个SNP标记构建了黄籽基因的遗传连锁图谱，克隆了控制种皮颜色的基因，该基因位于白菜型油菜A6连锁群[10]。Kebede等对白菜型黄籽沙逊油菜种皮颜色基因进行了QTL定位，共检测到4个QTL位点，其中一个主效QTL位点SCA9-2和一个微效QTL位点SCA9-1位于A9连锁群，其他两个微效QTL位点（SCA3-1和SCA5-1）分别位于A3和A5连锁群，共解释了67%的表型变异[11]。Xiao等对青海大黄油菜黄籽性状进行了遗传分析和基因定位研究，结果表明青海大黄油菜黄籽性状受一对隐性基因（Brsc1）控制，筛选到与Brsc1紧密连锁的10个AFLP标记（Y1至Y10）和3个SSR标记（CB10255、CB10022、CB10428），将其定位于白菜型油菜A9染色体上，同时构建了Brsc1基因所在区域的遗传连锁图谱[12]。

综上所述可见，前人对不同的白菜型黄籽油菜品种的黄籽基因进行了定位、克隆等研究，但是对于不同油菜品种的研究结果有所不同。本研究所用青海大黄油菜是起源于青藏高原的白菜型油菜地方品种，有能够稳定遗传的黄籽性状，是一种研究白菜型油菜黄籽性状的优异种质资源[13-14]。前人将大黄油菜黄籽基因Brsc1定位于A9染色体上特定区段，但标记数目有限，图谱饱和度不够。本研究在前人研究的基础之上，进一步扩大作图群体，结合分离体分组混合分析法（bulked segregant analysis，BSA法），在Brsc1所在染色体区段筛选新的与Brsc1连锁更为紧密的SSR标记，增加与Brsc1基因紧密连锁标记的数目，提高Brsc1遗传连锁图谱的标记密度，为大黄油菜黄籽基因的克隆创造条件。同时，检测所获SSR标记是否为共显性标记，用于大黄油菜分子标记辅助选择育种体系的建立。

1材料与方法

1.1试验材料和群体构建

本研究所用亲本材料为青海大黄油菜和一个白菜型油菜褐籽品系（编号09A-126），由青海省农林科学院春油菜研究所提供。两亲本均已连续自交或兄妹交8代以上，其种皮颜色性状均可稳定遗传。以大黄油菜为母本，09A-126为父本，F1代与大黄油菜回交，构建BC1群体，作为定位群体；F1同时自交，获得F2群体，F2中每一单株套袋自交获得F2：3家系，用于与目标基因连锁的共显性标记的筛选。

1.2DNA提取和性状调查分组

油菜苗期，采用CTAB法提取叶片总DNA[15]。测定每份DNA溶液的浓度，稀释至50 ng/μL，-20 ℃下保存备用。

油菜角果完全成熟后，分单株收获，晾干后考种。通过肉眼观察，考查每一单株的种皮颜色。根据考查结果，将BC1群体单株分为黄籽和褐籽两组。随机选取12个黄籽单株和12个褐籽单株，将单株DNA等量混合，分别构建两个黄籽基因池和两个褐籽基因池。根据F2群体中各单株的种皮颜色性状，将F2群体首先分为黄籽和褐籽两组，再根据F2 ∶3家系性状，将F2群体中的褐籽单株分为纯合褐籽（性状不分离）和杂合褐籽（性状分离）两组，最终将F2群体分为黄籽、杂合褐籽和纯合褐籽3组。

1.3SSR标记开发与检测

根据前人的研究结果，Brsc1被定位在白菜型油菜A9染色体上的一段2.8 Mb的区间内。从BRAD数据库（http：//brassicadb.org/brad/）下载Brsc1所在区间的序列信息，利用SSRHunter 1.3软件，进行微卫星筛选。然后利用Primer 3软件设计SSR引物（http：//frodo.wi.mit.edu/）。同时利用BRAD数据库中Brsc1所在区间内已有的SSR标记在我们的定位群体中进行多态性分析[16-19]。SSR引物由上海生工生物工程有限公司合成。SSR扩增反应参照梅德圣等的方法[20]。扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离检测。SSR引物首先在2对基因池中进行检测，表现为多态性的引物继续在BC1分离群体的单株中进一步进行分析，若仍然表现多态性，则确定为与Brsc1基因紧密连锁的标记。获得的特异SSR引物同时用F2群体中的单株进行检测，以确定其是否为共显性标记。

1.4SSR标记遗传图谱和物理图谱的构建

特异性SSR标记在BC1分离群体中进行重组单株的筛选，计算重组率，利用Kosamabi函数转换为遗传距离[21]。利用MAPMAKER/EXP3.0软件，构建Brsc1的SSR标记遗传图谱，并利用MapDraw V2.1作图软件进行遗传图谱和物理图谱的绘制[22]。

2结果与分析

2.1SSR标记开发与筛选结果

前人将Brsc1定位于A9染色体上Y06（19.3 Mb）和Y10（22.1 Mb）之间2.8 Mb的区间内。从BRAD数据库下载该区间部分序列，用于SSR引物的设计，并下载该区间已公布的SSR标记。用黄籽/褐籽基因池和BC1分离群体单株进行检测，共获得5个与Brsc1紧密连锁的特异性SSR标记：A-11-65、A-11-145、B-6-32、BrID10607和KS10760，引物序列信息见表1。 各特异性引物扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，条带多态性明显，带型清晰稳定，图1和图2所示分别为引物BrID10607和KS10760扩增结果。同时，5个特异性SSR标记对F2群体中的单株进行扫描，结果显示，A-11-65为共显性标记，能够区分黄籽、杂合褐籽和纯合褐籽单株（图3）。表1与青海大黄油菜黄籽基因Brsc1紧密连锁的SSR标记

SSR标记1引物名称1引物序列（5 ′→3′）1遗传距离

2.2SSR标记遗传连锁图谱和物理图谱的构建

本研究所构建BC1作图分离群体包含1 740个单株，6个与Brsc1表现连锁的SSR标记在BC1群体中进行重组单株的筛选，计算重组率，确定各连锁标记与Brsc1之间的遗传距离（表1）。将6个SSR标记与前人对Brsc1的定位结果进行比较和整合，构建Brsc1的遗传连锁图谱（图4）。各连锁SSR标记的物理位置见表1，使用作图软件绘制其物理图谱（图4）。新开发的6个SSR连锁标记位于Brsc1同侧，与Brsc1间的平均遗传距离为0.012 2，连锁紧密。新开发的SSR标记覆盖染色体上0.9 Mb的长度，图谱标记密度进一步增加。

3讨论

与前人所获得的分子标记相比，本研究筛选得到的5个与目标基因Brsc1紧密连锁的SSR标记与Brsc1之间的遗传距离进一步缩短，最近的标记为KS10760（0.005 7 cM）。将新获得的SSR标记与前人研究所得Brsc1的遗传连锁图谱进行整合，图谱标记密度进一步增加。高密度的遗传图谱是实现Brsc1图位克隆的关键。新开发的SSR标记位于Brsc1同侧，要实现Brsc1的克隆，在Brsc1另一侧还须开发更多与 Brsc1 距离更近的分子标记，将Brsc1锁定于更小的范围内。本研究所用作图分离群体较前人有所扩大，作图群体的扩大使连锁标记与目标基因之间的遗传距离测算更为准确，图谱精度进一步提高，且为连锁更紧密的分子标记的开发创造了条件。

Xiao等所得与Brsc1 紧密连锁的SSR标记，距离最近的为CB10022（0.8 cM），本研究新开发的SSR标记不但与Brsc1之间遗传距离大大缩短，而且得到一个共显性标记A-11-65（0.008 0 cM）。由于SSR标记具有操作简单，重复性好，成本较低等优点，因此被广泛应用于分子标记辅助选择育种。本研究所得到的SSR标记，不但与Brsc1连锁紧密，而且扩增条带清晰稳定，尤其是共显性标记的获得，能较准确地区分不同基因型的单株，因此很适用于建立白菜型黄籽油菜分子标记辅助选择育种体系。不足之处在于没有筛选到与Brsc1共分离的SSR标记，SSR连锁标记的数目也不够多，为提高分子标记辅助选择的准确率，还需要开发更多与Brsc1紧密连锁的分子标记。

本研究利用新开发的SSR标记进行遗传图谱构建，这些标记是根据目标基因所在特定区段的序列信息进行开发的。随着基因测序技术的发展，植物基因组序列信息数据库的不断完善，通过搜索数据库序列信息开发SSR引物越来越普遍。利用该方法进行目标基因的定位，目的性强，可快速筛选出与目标基因连锁的分子标记。但该方法需要以一定的定位结果为基础，并且需将目标基因锁定于较小的区段内，否则会增加SSR标记开发和筛选的难度。该方法还可用于开发SCAR、IP标记等，适用于目标基因的精细定位。

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