丁草胺污染对高产水稻土微生物区系的影响

2014-07-16张仕颖夏运生肖炜崔晓龙王永霞史静张乃明

生态环境学报 2014年4期

张仕颖，夏运生，肖炜，崔晓龙，王永霞，史静，张乃明*

1. 云南农业大学资源与环境学院，云南昆明 650201；2. 云南大学云南省微生物研究所，云南昆明 650091

云南永胜涛源乡是保持我国水稻小面积超高产纪录的特殊生态区。大量研究表明，这里不断刷新的水稻高产纪录得益于当地得天独厚的自然生态条件（Ying等, 1998a；Ying等, 1998b；Katsura等, 2008；Li等, 2009），尤其是土壤微生物，在其中起到至关重要的作用（段红平等，2007；李进学等，2007）。土壤微生物与土壤生态系统稳定性存在关联（Tilman等, 1996；Griffiths等, 2000），并且具有改善土壤质量，提高生态系统生产力的功能（Aboim等, 2008），因此可将土壤微生物作为灵敏的反映指标，表征土壤质量的演变趋势（张乃明，2013）。丁草胺是亚洲应用最广泛的苯乙酰胺类除草剂（Kumari等, 2009），与乙草胺和草甘膦并称我国三大除草剂（Xu等, 2005）。丁草胺主要应用于水稻田，对禾本科杂草有较好的防除效果，但由于使用量大，且直接毒土，不可避免地会在土壤和环境中残留，破坏土壤微生物群落结构，影响水稻产量（余保文和朱诚，2008；韩玉军和赵长山，2012）。涛源特殊生态区常年使用丁草胺作为水稻选择性芽前除草剂，大量施用的除草剂究竟会对土壤微生物群落结构造成多大影响成为研究者关注的焦点。目前关于丁草胺对普通水稻土微生物区系影响的研究较多（Min等, 2001；Suseela, 2001；Chen等,2009），但针对高产水稻土仅见从微生物功能多样性角度探索的相关报道（张仕颖等，2013）。本研究重点关注土壤微生物3大类群和3类常见有益功能微生物，探讨模拟条件下丁草胺对高产水稻土微生物区系的影响，可为系统评价丁草胺的生态毒理效应提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1 供试药品

50%丁草胺乳油，上海升联化工有限公司生产，农药登记号：D20091403，产品标准号：HG 3292—2001；施用方法：药土法。

1.2 土壤含水量测定

称取30～40 g（精确到0.01 g）新鲜土样置于培养皿中，放入110 ℃烘箱烘烤6 h，取出称质量；之后重新放回烘箱继续烘烤，每隔30 min重复称质量一次，直至恒质量，设置3个重复。土壤含水量计算公式为：

其中：m0表示烘干前样品质量，g；m1表示烘干后样品质量，g；wH2O表示土壤含水量（质量分数，%）。

1.3 丁草胺处理

丁草胺的合理施用标准为有效成分浓度747～1278 g·hm-2（国家质量技术监督局，2002），折算合每千克干土 0.216～0.370 mg，本研究取中间质量分数0.30 mg·kg-1作为100%推荐剂量。称取相当于500 g干质量的新鲜土样，加入超纯水使其含水量为田间最大持水量的 60%，在室内模拟条件下，添加以超纯水稀释的丁草胺乳油，使其在土样中的有效成分质量分数分别为 50%推荐剂量(0.15 mg·kg-1，简称 B15)、100%推荐剂量(0.30 mg·kg-1，简称 B30)和 500%推荐剂量(1.5 mg·kg-1，简称B150)，搅拌均匀，另设不加丁草胺的处理为对照（0 mg·kg-1，简称CK），每个处理3个重复。所有处理密封，置于恒温培养箱(25±1)℃中避光培养，于药剂处理后7、15、30、45 d取样测定，每隔2～3 d用差减法补充水分以调节含水量，供试土壤有机质质量分数为17.89 g·kg-1，全氮质量分数为 1.30 g·kg-1，全磷质量分数为 0.67 g·kg-1，碱解氮质量分数为101.65 mg·kg-1，有效磷质量分数为55.80 mg·kg-1，速效钾质量分数为 142.91 mg·kg-1，pH 7.84。

1.4 样品测定方法

分离好氧细菌（aerobic bacteria）使用牛肉膏蛋白胨培养基、真菌（fungi）使用马丁氏培养基、放线菌（actinobacteria）使用高氏一号培养基，分离自生固氮菌（nitrogen fixing bacteria）使用 Ashby无氮培养基、磷酸盐溶解菌（phosphate solubilizing bacteria）使用无机磷细菌培养基、硅酸盐细菌（silicate dissolving bacteria）使用硅酸盐细菌培养基（国家质量技术监督局，2006；钟传青，2004），所有培养基均调节至pH 7.5～8.0。

1.5 数据处理

试验数据使用SPSS 17.0软件处理，采用单因素（one way ANOVA）方差分析和LSD法进行多重比较（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 丁草胺对好氧细菌数量的影响

从图1可以看出，不同施药浓度对好氧细菌生长和增殖产生的影响不完全相同。施药7 d，100%和 500%推荐剂量表现出明显的刺激促生长作用，B30和B150的好氧细菌数量均与CK达到显著差异，比CK分别高出78.6%和153.8%；施药15 d和30 d，B30和B150的好氧细菌数量迅速下降至CK以下，表现出抑制好氧细菌生长和增殖的态势；施药45 d，抑制作用进一步加强，B30和B150的好氧细菌数量已经显著低于 CK；此外，50%推荐剂量B15的好氧细菌数量则变化不大，4个取样时间点数据均显示与CK基本保持在同一水平，没有出现明显的波动。纵观整个丁草胺处理时期，中、高浓度丁草胺对土壤好氧细菌的生长和增殖表现出先促进后抑制的作用，低剂量丁草胺对好氧细菌生长则没有太大影响。

图1 不同浓度丁草胺对好氧细菌数量的影响Fig. 1 Effect of different concentration of butachlor on bacteria number

2.2 丁草胺对放线菌数量的影响

从图2可以看出，施药7 d，B150表现出明显的刺激促生长作用，其放线菌数量显著高于 CK，差值达到75.1%，B15和B30则表现出明显的抑制作用，其放线菌数量显著低于 CK，差值分别达到74.5%和69.1%；施药15 d，B150的刺激作用和B15的抑制作用明显减弱，恢复到与CK相当水平，B30则表现出对放线菌生长明显的刺激作用，其放线菌数量比CK高出125.0%，达到显著差异；之后所有丁草胺处理的放线菌数量均保持在显著低于CK的水平，表现出明显的抑制作用。纵观整个丁草胺处理时期，中高浓度丁草胺对放线菌的生长有明显的刺激作用，丁草胺浓度越高，刺激作用表现得越快越明显，之后随着丁草胺的自然降解，刺激作用逐渐转化为抑制作用，低浓度丁草胺对放线菌生长则主要表现为抑制作用。

图2 不同浓度丁草胺对放线菌数量的影响Fig. 2 Effect of different concentration of butachlor on actinomyces number

图3 不同浓度丁草胺对真菌数量的影响Fig. 3 Effect of different concentration of butachlor on fungi number

2.3 丁草胺对真菌数量的影响

从图3可以看出，不同浓度丁草胺对真菌生长的影响不同。施药7 d，B30和B150显著低于CK，表现出明显的抑制作用，其真菌数量分别比CK低16.8%和43.6%；施药15 d，B30的真菌数量显著提高，超过CK56.9%，其余2个处理则与CK没有显著差异；施药30和45 d，B15和B30的真菌数量与CK处在同一水平，没有明显差异，B150则显著低于CK，30 d时比CK低27.8%，45 d时比CK低22.7%。纵观整个丁草胺处理时期，低浓度丁草胺B15对土壤真菌的生长和增殖基本没有影响，中等浓度B30则表现为先抑制后刺激的作用，随着丁草胺的自然降解，抑制和刺激作用都会消失，其真菌数量可恢复到CK水平；高浓度丁草胺B150则始终表现为抑制作用，其真菌数量与CK之间存在明显差异。

图4 不同浓度丁草胺对自生固氮菌数量的影响Fig. 4 Effect of different concentration of butachlor on nitrogen-fixingbacteria number

2.4 丁草胺对自生固氮菌数量的影响

从图 4可以看出，不同剂量丁草胺施入土壤对自生固氮菌均表现为先刺激、后抑制的作用。施药7 d，所有丁草胺处理自生固氮菌数量均显著高于对照，B15、B30和 B150比 CK分别高出237.1%，179.9%和138.1%，刺激作用显著。施药15 d，中低剂量处理自生固氮菌数量仍显著高于CK，但刺激作用明显减弱，B15和 B30分别比CK高出55.9%和20.9%，B150自生固氮菌数量则下降至与CK无显著差异，高剂量刺激作用消失。施药30 d，B15和B30自生固氮菌数量继续下降，与CK无显著差异，B150则继续下降至CK以下29.6%，达到差异显著，此时中低剂量丁草胺对自生固氮菌的促生长作用已消失，高剂量则表现出对自生固氮菌的抑制作用。施药45 d，基本情况与30 d时相似，中高剂量处理自生固氮菌数量进一步减少，B30和 B150比 CK分别低 20.5%和35.9%，抑制作用进一步加强。

2.5 丁草胺对磷酸盐溶解菌数量的影响

图5 不同浓度丁草胺对磷酸盐溶解菌数量的影响Fig. 5 Effect of different concentration of butachlor on phosphate solubilizing bacteria number

图6 不同浓度丁草胺对硅酸盐细菌数量的影响Fig. 6 Effect of different concentration of butachlor on silicate dissolving bacteria number

从图5可以看出，不同浓度丁草胺施入土壤会对磷酸盐溶解菌表现出不同程度的抑制作用。纵观整个丁草胺处理时期，500%推荐剂量B150的磷酸盐溶解菌数量始终处于一个较低的水平，磷酸盐溶解菌的生长和增殖受到强烈抑制；100%推荐剂量B30的磷酸盐溶解菌数量也始终显著低于 CK，但其抑制强度远不及 B150处理明显；50%推荐剂量B15对磷酸盐溶解菌则表现出微弱的抑制作用，虽然其磷酸盐溶解菌数量在整个丁草胺处理时期均低于 CK，但都未达到显著差异。可见施用丁草胺会对高产水稻土磷酸盐溶解菌群落产生不利影响，能够抑制磷酸盐溶解菌的生长和增殖，且丁草胺浓度越高，抑制作用越明显。

2.6 丁草胺对硅酸盐细菌数量的影响

从图6可以看出，丁草胺浓度不同，对硅酸盐细菌数量的影响也不同。纵观整个丁草胺处理时期，50%推荐剂量B15的硅酸盐细菌数量在施药7 d时有一小幅增加，之后基本保持稳定，但4次取样均未与CK达到显著差异；100%推荐剂量B30和500%推荐剂量 B150的硅酸盐细菌数量则始终与CK保持显著差异，B30的硅酸盐细菌数量在4个取样时间点基本保持恒定，B150则在施药7和15 d时较低，分别比CK低60.7%和58.1%，到施药30 d后达到一个相对稳定的状况。可见高产水稻土的硅酸盐细菌数量与丁草胺的施用浓度密切相关，低浓度对硅酸盐细菌影响不明显，中高浓度对硅酸盐细菌有抑制作用，且在丁草胺达到半衰期之前，浓度越高，抑制作用越明显。

3 讨论

由于丁草胺应用范围广、使用量大，对土壤环境的影响较为直接，目前国内外也有一些关于施用丁草胺后对土壤微生物区系影响的相关报道。在三大微生物数量方面，Min发现施用不同浓度丁草胺后，土壤放线菌数量显著下降，细菌和真菌数量上升，22 mg·kg-1高质量分数丁草胺可导致真菌生长迟滞（Min等, 2001）；单敏发现10 mg·kg-1高质量分数下细菌、真菌和放线菌均受到抑制，2～4 mg·kg-1丁草胺对放线菌生长有刺激作用（单敏等，2005）；赵兰则发现低浓度对细菌有刺激作用，20 mg·kg-1高质量分数对放线菌有抑制作用，各浓度处理对真菌均表现为先抑制后刺激（赵兰和黎华寿，2008）。在功能微生物数量方面，施用丁草胺可影响解磷微生物的生长和活性（Dennath等, 2002），刺激水解发酵性细菌（Min等, 2001）、硫酸盐还原细菌（Min等, 2001；陈中云等，2004）和反硝化细菌（Min等, 2001；陈中云等，2003a）生长，抑制产氢产乙酸细菌（Min等, 2001）生长，对甲烷产生菌的影响则与浓度相关，低浓度加速生长，高浓度抑制生长，施药7 d时抑制作用最大（Min等, 2001；陈中云等，2003b）。此外，研究者还通过乙炔还原法和液体培养最大或然计数法测定了水稻土中厌氧固氮菌和反硝化细菌的数量，发现施用丁草胺后可加强微生物群落的固氮作用（Min等, 2001；Suseela, 2001；Chen等, 2009）和反硝化作用（Min等, 2001）。虽然研究者采用不同浓度组合进行模拟试验，但结果仍有共性，综合前人和本研究结果可以发现，施用丁草胺会对土壤微生物区系造成影响，影响方向和影响程度与微生物种类和丁草胺浓度密切相关。

平板培养法是微生物研究中最经典也最行之有效的方法之一，其优势在于可获得微生物纯菌株，并可计算自然样品中可培养的活的微生物数目，在研究微生物种群结构、生理生化特性、遗传育种以及开发利用微生物资源方面具有不可取代的重要地位。因此，即使在分子生物学手段日新月异的今天，对自然界微生物的研究依旧离不开传统的平板培养手段。但同时必须指出，平板培养法的培养条件系人为限定，常会因为营养条件的原因造成某些微生物的富集生长和另一些微生物的缺失，在一定程度上影响着对微生物群落结构评价的准确性，且自然界能够被培养的微生物一般只占微生物总量的1%～10%（Daniel, 2005；Torsvik和Ovreas,2002），绝大数微生物可以在自然环境中存在，却无法在人工条件下生长（张洪勋等，2003），因此还需结合其它生物技术方能客观而全面地反映微生物群落的真实信息（孔维栋等，2004）。

4 结论

本研究通过分析模拟条件下丁草胺污染对高产水稻土微生物区系的影响，得到以下结论。

1）中高浓度丁草胺对好氧细菌具有先刺激生长、后抑制活性的作用，低浓度丁草胺对好氧细菌的生长和增殖影响不明显。

2）中高浓度丁草胺对放线菌有刺激作用，且浓度越高，刺激作用表现得越快越明显，低浓度丁草胺对放线菌则主要表现为抑制作用。

3）低浓度丁草胺对真菌的生长和增殖基本没有影响，中等浓度有先抑制后刺激的作用，高浓度丁草胺则始终表现为对真菌的抑制作用。

4）不同浓度处理丁草胺均能刺激自生固氮菌的数量显著增加，但随着培养时间延长，高浓度开始表现出抑制作用。

5）不同浓度丁草胺均能抑制磷酸盐溶解菌的生长和增殖，且丁草胺浓度越高，抑制作用越明显。

6）低浓度丁草胺对硅酸盐细菌的数量影响不明显，中高浓度则对其有抑制作用，且浓度越高抑制作用越明显。

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