IAC-HPLC法检测牛奶中黄曲霉毒素和玉米赤霉醇及类似物质量分数

王昕，姚佳，果旗，里南，江帆，王雄，张建新

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.北京中检维康技术有限公司，北京 100044)

0 引 言

黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2， 加上2种代谢物M1、M2可以直接污染食品和饲料，对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时，可导致肝癌甚至死亡[1]。

玉米赤霉醇是玉米赤霉菌在生长过程中的次生代谢产物[2]。α-玉米赤霉醇及类似物都属于雷索算内酯类药物[3]。玉米赤霉醇曾作为反刍动物家畜牛羊的生长促进剂，但后来研究表明，其在动物组织中的残留会影响人体健康，甚至在外部条件诱导下，具有致癌作用[4-5]。

目前针对这两大类物质的检测方法主要有HPLC(高效液相色谱法)、TLC (薄层层析法)、LC-MS/MS(液质联用)及ELISA(酶联免疫)法[6-9]。 其中ELISA法使用较为普遍，但该方法定量误差较大，仅可作为阳性样品的初筛工具[10]，目前针对这两大类物质多采用单独分析方法来定量[11-14]。

1 实 验

1.1 试剂

甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，去离子水，黄曲霉毒素(标准品)，玉米赤霉醇类(标准品)；黄曲霉毒素玉米赤霉醇复合免疫亲和柱(AZ复合免疫亲和柱)。

1.2 仪器

L-2485型高效液相色谱仪带荧光检测器，SPD-10A型高效液相色谱仪带紫外检测器，光化学衍生器，800D型离心机，泵流操作架，DCY-12S型氮吹仪，微型涡旋混合器。

1.3 方法

1.3.1 去脂

量取牛奶样品60 mL，将样液移入2个50 mL离心管中以4 000 r/min离心15 min，去除上层脂肪备用。

1.3.2 富集和净化

将免疫亲和柱置于泵流操作架上，取50.0 mL去脂奶以1滴/s的流速全部通过AZ复合亲和柱，待溶液全部流出后，用10.0 mL纯水以1～2滴/s的流速淋洗亲和柱，待纯水全部流出后，取干净玻璃小管置于亲和柱下，用2.0 mL甲醇以1滴/s淋洗亲和柱，将所有样品淋洗液收集于玻璃小管中，于50℃氮气下吹干，然后用体积比为50∶50的甲醇水定容至500 μL。黄曲霉毒素按照HPLC-荧光检测条件检测，玉米赤霉醇及其类似物按照HPLC-UV检测条件进行检测。

1.3.3 标准品配制

黄曲霉毒素6种标准品的配置与标准曲线的建立：6种混合标准品用50%的甲醇配制，质量浓度分别为0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/L，供液相色谱检测，建立标准曲线。

玉米赤霉醇及其类似物6种标准品的配置与标准曲线的建立：6种混合标准品用50%甲醇配制，质量浓度分别为3.125，6.25，12.5，25，50 μg/L，供液相色谱检测，建立标准曲线

1.4 色谱条件

(1)HPLC-荧光条件。Cloversil-C18柱 子 (4.6 mm×250 mm，5 um)；流动相为V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=11∶4∶5；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测器为荧光检测器；激发波长355 nm，发射波长430 nm，进样量为20 μL。

(2)HPLC-UV 条件。 色谱柱：Cloversil-C18柱子(4.6 mm×250 mm，5 um)；流动相为V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=40∶5∶55；流速为1.0 mL/min；柱温为室温；检测器为紫外检测器；波长265 nm；进样量50 μL。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择

2.1.1 提取方法的选择

黄曲霉毒素和玉米赤霉醇类的检测，通常采用有机溶剂甲醇、乙腈等作为提取剂，鉴于本试验中牛奶样品液态、体系均匀的特殊形态，尝试样品直接过柱的方法。结果表明，直接过柱的方法，六种黄曲霉毒素的回收率均在90%以上，玉米赤霉醇及其类似物的回收率相对较低，但结果稳定，综合考虑试验的回收率结果和试验操作的简便性，采用直接过柱的方法。

2.1.2 免疫亲和柱净化条件的优化

当淋洗液为10 mL时，杂质基本可以去除，6种黄曲霉毒素和6种玉米赤霉醇及其类似物均未被洗脱下来。随着洗脱液甲醇的用量增加，回收率提高，当体积大2 mL时，12种物质的回收率趋于稳定。因此，本法采用10 mL水作为淋洗液，2 mL甲醇作为洗脱液。

2.2 色谱条件的选择

6种黄曲霉毒素，采用Cloversil-C18柱子(4.6 mm×250 mm，5 um)色谱柱进行分离，以V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=11∶4∶5为流动相，激发波长355 nm，发射波长430 nm下荧光检测。6种玉米赤霉醇及其类似物，采用loversil-C18柱子(4.6 mm×250 mm，5 um)；以V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=40∶5∶55为流动相，波长265 nm下紫外检测 。在这两种检测条件下，所得色谱图的保留时间、峰形及峰高均能满足要求。 图1为AFM2，AFM1，AFG2，AFG1，AFB2，AFB1质量浓度分别为5.0，5.6，1.6，5.8，1.7，5.7 μg/L的色谱；，图2为6种玉米赤霉醇及其类似物的质量浓度为均为50.0 μg/L的色谱。

图1 黄曲霉毒素标准色谱

图2 玉米赤霉醇类标准色谱

2.3 方法评价

2.3.1 线性范围和检测限

分别配置质量浓度分别为0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/L黄曲霉毒素系列混合标准溶液，以峰面积对质量浓度绘制标准曲线，6种黄曲霉毒素均呈良好线性关系(见表1)，以信噪比(S/N≥3)为方法检测限，黄曲霉毒素M2，M1，G2，G1，B2，B1的检测限分别为0.4，0.4，0.4，0.3，0.2，0.2 μg/L，牛奶样品浓缩了100倍，所以样品中黄曲霉毒素M2，M1，G2，G1，B2，B1的检出限分别为0.004，0.004，0.004，0.003，0.002 ，0.002 μg/L。 分别配置质量浓度分别为3.125，6.25，12.50，25.0，50.0 μg/L的玉米赤霉醇及其类似物系列混合标准溶液，以峰面积对质量浓度绘制标准曲线，6种物质均呈良好线性关系(见表2)，以信噪比为(S/N≥3)为方法检测限，玉米赤霉醇及其类似物液相色谱的方法检测限为5 μg/L，牛奶样品浓缩了100倍，所以样品中玉米赤霉醇及其类似物的检测限为0.05 μg/L。本法灵敏度高。

2.3.2 方法的回收率和精密度

选择市面上普通的纯牛奶添加黄曲霉毒素标准品和玉米赤霉醇类标准品进行样品处理，测定回收率；分别取5份牛奶按1.3方法处理后上机检测，测定方法精密度。黄曲霉毒素的平均添加回收率在91.20%～113.8%之间，RSD值在4.53%～8.79%之间。玉米赤霉醇类的平均添加回收率在54.22%～90.76之间，RSD值在1.90%～9.44%之间(见表3～表6)。

表1 黄曲霉毒素线性回归方程、相关系数

表2 玉米赤霉醇类线性回归方程、相关系数

表3 样品中黄曲霉毒素回收率的测定结果

表4 样品中黄曲霉毒素精密度测定结果

表5 样品中玉米赤霉醇及其类似物回收率测定结果

表6 样品中玉米赤霉醇及其类似物精密度的测定结果

3 结 论

免疫亲和柱中的抗体能对目的检测物进行特异性吸附，杂质影响小，专一性强，复合柱更使得多种物质可以同时净化，本试验采用AZ复合免疫亲和柱对样品进行一次性净化，再在不同条件下分别检测黄曲霉毒素和玉米赤霉醇及其类似物含量，样品只需经过一次性前处理，简单高效。 黄曲霉毒素M2，M1，G2，G1，B2，B1的检测限分别为0.004， 0.004， 0.004， 0.003， 0.002，0.002 μg/L，平均加标回收率在91.20%～113.8%之间，变异系数小于8.79%；玉米赤霉醇及其类似物的检测限均为0.05 μg/L，平均回收率在54.22%～90.76%之间，变异系数小于9.44%。所得结果均在可接受范围内，该方法适用于牛奶中黄曲霉毒素和玉米赤霉醇及其类似物的快速检测。

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