高效液相色谱-串联质谱法同时测定食用油中的16种抗氧化剂*

朱臻怡，魏云计，冯民，王小晋，熊华萱，何健

（中华人民共和国淮安出入境检验检疫局，江苏淮安 223001）

高效液相色谱-串联质谱法同时测定食用油中的16种抗氧化剂*

朱臻怡，魏云计，冯民，王小晋，熊华萱，何健

（中华人民共和国淮安出入境检验检疫局，江苏淮安 223001）

利用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS／MS）同时测定食用油中16种抗氧化剂。食用油中的抗氧化剂经正己烷溶解、含L-抗坏血酸棕榈酸盐的乙腈萃取后，经C18柱分离，乙腈-0.1%甲酸溶液体系为流动相进行梯度洗脱，多反应监测模式（MRM）检测，外标法定量。16种抗氧化剂呈良好的线性关系（r2=0.991 2～0.998 8），方法的测定低限为0.1～0.5 mg／kg，在测定低限浓度水平下的平均回收率为78.6%～101.2%，相对标准偏差为3.50%～13.19%（n=10）。该方法准确、灵敏、重现性好，可用于食用油中16种抗氧化剂的检测。

高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS／MS）；抗氧化剂；食用油

食品抗氧化剂是一类食品添加剂，为防止食用油脂酸败而产生对人体有害的物质，往往需要在其中添加抗氧化剂用于预防脂质氧化。一些合成抗氧化剂不是食品的成分之一，相当多的动物实验证明，抗氧化剂具有一定的毒性和致癌作用，会影响人体的健康［1］，而在食品工业领域存在着不少违规添加、过量添加的现象。随着食品中化学品残留问题的日趋严重和食品安全问题的国际化，许多国家对抗氧化剂的添加量进行严格的限制或明确规定其添加量，美国、日本、欧盟等国家和地区已禁止使用一些合成抗氧化剂［2］。针对目前这种状况，有必要建立一种能同时测定多种抗氧化剂的分析方法，以适应食用油检验的需要。

不少厂家常常在食品生产过程中同时添加几种抗氧化剂以实现更好的抗氧化效果［3］。目前，抗氧化剂的检测方法主要有比色法［4］、气相色谱法［5］、高效液相色谱法［6］等。国家标准和行业标准［7-11］也有利用气相色谱法和高效液相色谱法测定食用油中的抗氧化剂的方法。近年来一些文献报道了液相色谱-串联质谱（LC-MS／MS）法［12-15］在测定调味料和饲料中多种抗氧化剂方面的应用。上述测定方法或抗氧化剂种类涉及较少，不能满足日益增多的抗氧化剂品种测定的需要；或是方法复杂耗时，不适用于大批量样品的处理。食用油中16种抗氧化剂［丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）、特丁基对苯二酚（TBHQ）、没食子酸丙酯（PG）、没食子酸辛酯（OG）、没食子酸十二酯（DG）、4-己基间苯二酚（HR）、乙氧基喹啉（EQ）、正二氢愈创酸（NDGA）、槲皮素（QR）、2，4，5-三羟基苯丁酮（THBP）、2，6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚（HMBP）、芦丁（Rutin）、2，6-二叔丁基-4 -甲氧基苯酚（Ionox-100）、没食子酸异戊酯（IAG）、2，5-二特丁基对苯二酚（BHQ）］的同时分离测定尚未见报道。

笔者在前人工作基础上利用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS／MS）技术对食用油中16种抗氧化剂同时测定进行研究，优化了样品前处理方法，建立了简单、快速、准确测定食用油中16种抗氧化剂的方法。该方法灵敏度高，检测效率高，检测限低，线性范围宽，为食用油中抗氧化剂的检测提供了实用的技术手段，对监测食用油中添加剂的使用情况具有重要意义。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱-串联质谱仪：三重四级杆质谱联用仪，TSQ Quantum Ultra EMR型，配有电喷雾离子源（ESI），美国Thermof i sher公司；

电子天平：PB-203E型，瑞士梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；

恒 温 氮 吹 装 置：N-EVAP14165型，美 国Organomation联合公司；

数控超声清洗器：KH-800KDB型，昆山禾创超声仪器有限公司；

旋转蒸发仪：Buchi Rotavapor R-215型，瑞士Buchi公司；

正己烷、甲醇、乙腈、甲酸：色谱纯，德国Merck公司；

BHA标准品：纯度为100%，美国AccuStandard公司；

BHT，EQ，PG，Rutin，TBHQ标准品：纯度分别为99.5%，96.5%，99.0%，96.6%，99.8%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

BHQ，DG，IAG，HMBP，HR标准品：纯度分别为99.4%，99.5%，99.9%，＞97.0%，＞98.0%，日本TCI公司；

THBP标准品：美国APOLLO公司；

NDGA，Ionox-100，OG标准品：纯度分别为97%，99.9%，99.6%，英国Alfa Aesar公司；

QR标准品：纯度为93.4%，美国ChromDex公司；

L-抗坏血酸棕榈酸盐（AP）：纯度为99.0%，美国Sigma公司；

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Theomo Hypersil GOLD柱（100 mm× 2.1 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液；梯度洗脱程序：流量为0.25 mL／min，乙腈体积分数30%保持2 min，以1.5%／s增加到90%，保持3.7 min，再以-2%／s降至30%，保持3 min；柱温：30℃；进样体积：25μL。

1.2.2 质谱条件

离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）和电喷雾电离负离子模式（ESI-）；质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；各氧化剂对应的监测离子及其碰撞能量见表1。

表1 多反应监测方法测定的质谱条件参数

1.3 样品预处理

含AP的正己烷饱和的乙腈溶液配制：将正己烷和乙腈混合，在分液漏斗中充分振摇，使其相互饱和。静置分层，收集下层溶液，并于每升溶液中溶解0.1 g AP。

1.3.1 提取

准确称取混合均匀的样品2.00 g（精确到0.01 g）于250 mL磨口锥形瓶中，加入10 mL乙腈饱和的正己烷稀释样品，再加入10 mL饱和氯化钠溶液，在旋涡混合器上涡旋振荡2 min以充分溶解。用30mL含AP的正己烷饱和的乙腈溶液（每次10 mL，分3次）提取，每次振荡并超声各10 min，合并乙腈提取液于250 mL分液漏斗中。

1.3.2 净化定容

用10 mL饱和氯化钠溶液洗涤乙腈提取液一次，弃去下层。乙腈层用无水硫酸钠脱水后，在低温旋转蒸发仪中浓缩至近干，残液用氮气吹干并用1 mL乙腈-水溶液（体积比为1∶1）充分溶解后过0.22 μm滤膜，用高效液相色谱-质谱／质谱仪测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱流动相的选择

根据固定相的适用范围和拟分析抗氧化剂的结构特性，采用Thermo Hypersil GOLD反相C18柱（100 mm×2.1 mm，5μm）进行样品分析，柱效高，分离效果好。由于采用电喷雾（ESI）模式，首先比较甲醇、乙腈作流动相时各目标物的响应值和峰形，选择乙腈作为有机流动相；其次，由于目标分析物大多数是极性比较强的酚类化合物，易分解，因而常出现色谱峰拖尾、变宽和不对称等现象，在流动相中加入适量的酸性抑制剂（如甲酸）改善峰形。实验比较了水相中甲酸体积分数（0.05%，0.1%，0.2%）对目标物离子化效率的影响，最终确定0.1%甲酸水溶液-乙腈作为流动相。

2.2 梯度洗脱程序

试验表明，采用等度洗脱不能将多种抗氧化剂完全分离，为了保证这些物质在较短的时间内获得较好的分离和较高的灵敏度，需采用梯度洗脱程序。由于测定的目标分析物种类较多，部分在谱图上的保留时间接近，因此流动相梯度的选择对分离很重要。在优化的流动相条件下，反复试验并确定了梯度洗脱程序。

2.3 提取过程

研究的抗氧化剂大多为极性物质，易溶于极性较强的油脂及有机溶剂，如乙醇、甲醇、乙腈等。实验选择不同的溶剂来提取，由添加回收试验比较发现，乙腈的提取回收率较高，且测定干扰较少，因此选择乙腈为提取液。提取前用正己烷溶解油脂以降低溶液黏度，可进一步提高提取效果；然后加入饱和氯化钠溶液将不溶于正己烷的样品在水相中充分分散，使目标分析物不被样品颗粒包裹，进一步提高了乙腈的提取效果。提取时在乙腈中加入保护剂AP，AP对金属离子有螯合作用，能促进氧化的微量金属离子钝化，降低目标分析物在提取和浓缩过程中被氧化的程度，提高方法的回收率与灵敏度。由于正己烷和乙腈之间有一定的互溶性，所以实验采用的正己烷和乙腈分别为经乙腈饱和的正己烷和经正己烷饱和的乙腈。

2.4 样品色谱图

在1.2仪器工作条件下，以食用油样品为基质，添加各测定低限浓度水平的抗氧化剂混合标准溶液，添加样品的监测离子色谱图如图1所示。由图1可知，16种抗氧化剂与食用油基质成分分离良好。

图1 16种抗氧化剂测定低限添加水平的样品监测离子色谱图

2.5 线性范围与测定低限

在确定的实验条件下，以信噪比（S／N）=10时的检测浓度作为测定低限，用乙腈-水溶液（体积比为1∶1）将配制的混合标准溶液稀释成1，2，5，10，20，50倍测定低限浓度的系列标准溶液，然后进行测定。以峰面积Y对相应抗氧化剂的质量浓度X（mg／L）进行线性回归，结果表明待测化合物的质量浓度与对应的峰面积呈现良好的线性关系（见表2），测定低限均不大于0.5 mg／kg。

表2 抗氧化剂测定低限和线性范围

2.6 方法精密度与回收率

以尽量不含或含少量以上各抗氧化剂的食用油为空白样品基质，进行1倍测定低限浓度水平的添加回收试验，平行测定10次，测定结果见表3。

表3 样品中添加抗氧化剂的回收率及变异系数（n=10）

由表3可知，以高效液相色谱-串联质谱法测定16种抗氧化剂的平均回收率在78.6%～101.2%之间，测定结果的相对标准偏差为3.50%～13.19%。测量精密度与回收率符合国家关于残留分析对准确度与精密度的要求［16］。

3 结语

以高效液相色谱-串联质谱法同时检测食用油中的BHA，BHT，TBHQ，PG，OG，DG，HR，EQ，NDGA，QR，THBP，HMBP，Rutin，Ionox-100，IAG，BHQ等16种抗氧化剂，方法灵敏、准确，测定低限值低于国内、国际对上述抗氧化剂的最大允许水平，能够满足实际应用的需要。

［1］ 杨洋，韦小英，阮征．国内外天然食品抗氧化剂的研究进展［J］．食品科学，2002，23(10): 137-140．

［2］ 天津进出口商品检验局.各国食品添加剂［M］.天津：天津科学技术出版社，1989: 531-539.

［3］ 蔡发，段小娟，牟志春，等.高效液相色谱法同时测定食品中的12种抗氧化剂［J］．食品科学，2010，31(8): 207-211．

［4］ 姜晓辉．食品中抗氧化剂BHA、BHT、TBHQ和PG的检测［J］．计量与测试技术，2009，36(10): 78-79．

［5］ 李兴根，韩芷玲.毛细管气相色谱法测定食品中的酚类抗氧化剂［J］．粮油食品科技，2006，14(2): 55-56．

［6］ 胡小钟，余建新，孙国保，等．用高效液相色谱法同时测定油脂中的9种抗氧化剂［J］．分析测试学报，1999，18(5): 21-24．

［7］ GB／T 5009.30-2003 食品中叔丁基羟基茴香醚（BHA）与2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）的测定［S］．

［8］ GB／T 5009.32-2003 油脂中没食子酸丙酯（PG）的测定［S］.

［9］ GB／T 23373-2009 食品中抗氧化剂丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）与特丁基对苯二酚（TBHQ）的测定［S］.

［10］ SN／T 1050-20023 进出口油脂中抗氧化剂的测定［S］.

［11］ NY／T 1602-2008 植物油中叔丁基羟基茴香醚（BHA）、2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）和特丁基对苯二酚（TBHQ）的测定高效液相色谱法［S］.

［12］ 林安清，张曼，唐丹州，等.液相色谱-串联质谱法同时检测饲料中多种抗氧化剂［J］．分析测试学报，2007，26(1): 278-280．

［13］ 凌云，储晓刚，张峰，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定调味料中的17种防腐剂和抗氧化剂［J］．色谱，2011，29(8): 723-730．

［14］ 蔡发，段小娟，牟志春，等.液相色谱-串联质谱法测定食品中的12种抗氧化剂［J］.分析测试学报，2012，31(12): 45-49.

［15］ 李秀勇，牟峻，刘惠涛，等.超高效液相色谱-质谱法测定油脂中的10种抗氧化剂［J］.分析化学简报，2008，36(3): 369-372.

［16］ SN／T 0001-1995 出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定［S］.

Simultaneous Determination of 16 Antioxidants in Edible Oil Using High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry

Zhu Zhenyi, Wei Yunji, Feng Min, Wang Xiaojin, Xiong Huaxuan, He Jian
（Huaian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huaian 223001, China）

A method was developed for the simultaneous determination of 16 antioxidants in edible oil using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The antioxidants in the sample were dissolved with hexane, extracted with acetonitrile containing ascorbyl palpitate, separated on a reversed-phase C18column with a mobile phase of acetonitrile-water containing 0.1% formic acid by gradient elution. The detection was performed by MS／MS under multiple reaction monitoring （MRM）mode, and the quantitation was carried out by the external standard method. The calibration curves showed good linearities for 16 antioxidants with correlation coeff i cients of 0.991 2-0.998 8. The determination limits of 16 antioxidants were between 0.1 mg／kg and 0.5 mg／kg. Sample were fortif i d at the level of the limit of determination with the antioxidants mixed standard solution. The recoveries were between 78.6% and 101.2%, and the relative standard deviations of repeatability were between 3.50% and 13.19%（n=10）. The method is reliable, sensitive and reproducible, and can be applied in the determination of 16 antioxidants in edible oil.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; antioxidants; edible oil

O657.6

A

1008-6145（2014）02-0023-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.02.007

*江苏出入境检验检疫局科技项目（2012KJ30）

联系人：朱臻怡；E-mail: zhuzhenyi1976@sina.com

2014-01-06