墨兰ISSR—PCR反应体系建立及优化

张睿等

摘要：为建立墨兰的ISSR-PCR反应体系，采用正交试验分析了5个因素

1引言

墨兰（Cymbidium sinense）花瓣香气浓郁、花色多变、叶形独特，是国兰中株型最大，花茎最长的种类。目前对于墨兰的研究主要集中在形态学、生理学及孢粉学上，而在分子DNA水平上研究很少[1，2]。ISSR是1994年由Zietkiewiczetal提出的一种新型分子标记技术[3]，该技术在SSR（即简单序列重复）技术的基础上有所发展，使实验操作简便且迅速，稳定性好，多态性高，现今在基因定位、遗传作图、遗传多样性、进化以及系统发育等研究中被广泛应用[4]。不同植物对ISSR-PCR反应体系要求不同，因此在利用ISSR标记之前，必须建立该种植物最适ISSR-PCR反应体系。本研究旨在通过正交试验分析模板DNA、TagDNA聚合酶、Primer、Mg2+和dNTPs 5个因子在4个水平上对墨兰ISSR-PCR反应影响，并据此建立墨兰最适ISSR-PCR反应体系，为利用ISSR标记对其进行后续研究奠定基础。

2材料与方法

试验材料墨兰来源于国家林业局保育重点实验室。试验方法包括以下3种。

（1）墨兰基因组DNA提取。采用改良CTAB法[5]提取墨兰基因组DNA。

4结语

采用正交试验分析5个因素（Tag酶浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度）在4个水平上对ISSR-PCR反应的影响，结果表明：Tag酶浓度为16U/25μL、Mg2+浓度为24mmol/L、dNTP浓度096 mmol/L、Primer浓度为064μmol/L、DNA浓度32ng/25μL是墨兰ISSR-PCR最优反应体系。Tag酶用量直接影响扩增反应成功与否，浓度过高造成浪费，但如果Tag酶浓度过低，会导致产物合成效率下降。Mg2+ 浓度主要是通过影响Tag酶活性从而影响PCR反应。dNTP作为PCR反应的原料，浓度太低会使扩增不完全，从而降低PCR产物产量；浓度过高会对Mg2+产生抑制作用，降低Mg2+的有效浓度，影响Tag酶的活力，造成浪费。本试验验结果为进一步建立优化、系统的ISSR-PCR反应体系提供了初步的科学数据，利用ISSR分子标记技术对墨兰进行种质资源鉴定、遗传多样性及遗传图谱构建等研究奠定了基础。

参考文献：

[1] 张孟锦，杨志娟兰花育种途径与进展[J]广东农业科学，2008（2）：120～123

[2] 郑万均，傅立国中国植物志[M]第十八卷，1999

[3] Zietkiewicz E，Rafslski A，L abuda DGenome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amp lification[J]Genomics，1994（20）：176～183

[4] 王建波ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J]遗传，2002，24（5）：613～616

[5] 孙正海，王锦，李世峰，等滑叶藤ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]云南农业大学学报，2012，27（5）：746～750

[6] 李爱民，秀麟，陈功锡墨兰解剖学研究[J]热带亚热带植物学报，2002，10（4）：295～300

[7] 刘塔斯，林丽美，龚力民，等分子标记中植物DNA提取方法的研究进展[J]中南药学，2005，3（6）：0370～04

[8] 项艳，於安凤，彭镇华墨兰离体快繁研究[J]林业科学研究，2003，16（4）：434～438

[9] 何正文，刘运生，陈立华正交设计直观分析法优化PCR条件[J]湖南医科大学学报，1998，23（4）：03～404

[10] 刘峰，顾志敏，陈析丰，等长春花ISSR-PCR反应体系的正交优化[J]安徽农业科学，2010，38（5）：2261～2263

[11] 黄执缨墨兰花朵发育和衰老生理的初步研究[J]生物学杂志，2008，20（4）：26～28

[12] 严华，张冬梅，罗玉兰，等38种国兰亲缘关系的ISSR分析[J]分子植物育种，2010，8（4）：736～741

[13] 吴振兴，王慧中，施农农，等兰属植物ISSR遗传多样性分析[J]生物科技，1999，30（5）：627～632

[14] 董如何，肖必华，方永水正交试验设计的理论分析方法及应用[J]安徽建筑工业学院学报：自然科学版，2004，12（6）：103～106

Abstract：In order to establish theISSR-PCR reaction systemofISSR-PCR reactionsystem，this article usesorthogonalexperiment to analyze the influences of fivefactors including Tagenzyme concentration，Mg2+ concentration，DNA templateconcentration，primer concentration，and dNTP concentrationatfourlevelsof the orthogonal teston theCymbidiumISSR-PCRreaction systemThe results show thatwhen Tag enzyme concentrationis 16U/25μl，Mg2+ concentration is 24mmol/L，dNTPconcentration is 096 mmol/L，concentration of primeris 064μmol/L，DNAconcentrationis 80ng/25μl，theISSR-PCRreaction system is optimal

Key words：Cymbidium sinense；ISSR-PCR reactionsystem；optimizationendprint

摘要：为建立墨兰的ISSR-PCR反应体系，采用正交试验分析了5个因素

1引言

墨兰（Cymbidium sinense）花瓣香气浓郁、花色多变、叶形独特，是国兰中株型最大，花茎最长的种类。目前对于墨兰的研究主要集中在形态学、生理学及孢粉学上，而在分子DNA水平上研究很少[1，2]。ISSR是1994年由Zietkiewiczetal提出的一种新型分子标记技术[3]，该技术在SSR（即简单序列重复）技术的基础上有所发展，使实验操作简便且迅速，稳定性好，多态性高，现今在基因定位、遗传作图、遗传多样性、进化以及系统发育等研究中被广泛应用[4]。不同植物对ISSR-PCR反应体系要求不同，因此在利用ISSR标记之前，必须建立该种植物最适ISSR-PCR反应体系。本研究旨在通过正交试验分析模板DNA、TagDNA聚合酶、Primer、Mg2+和dNTPs 5个因子在4个水平上对墨兰ISSR-PCR反应影响，并据此建立墨兰最适ISSR-PCR反应体系，为利用ISSR标记对其进行后续研究奠定基础。

2材料与方法

试验材料墨兰来源于国家林业局保育重点实验室。试验方法包括以下3种。

（1）墨兰基因组DNA提取。采用改良CTAB法[5]提取墨兰基因组DNA。

4结语

采用正交试验分析5个因素（Tag酶浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度）在4个水平上对ISSR-PCR反应的影响，结果表明：Tag酶浓度为16U/25μL、Mg2+浓度为24mmol/L、dNTP浓度096 mmol/L、Primer浓度为064μmol/L、DNA浓度32ng/25μL是墨兰ISSR-PCR最优反应体系。Tag酶用量直接影响扩增反应成功与否，浓度过高造成浪费，但如果Tag酶浓度过低，会导致产物合成效率下降。Mg2+ 浓度主要是通过影响Tag酶活性从而影响PCR反应。dNTP作为PCR反应的原料，浓度太低会使扩增不完全，从而降低PCR产物产量；浓度过高会对Mg2+产生抑制作用，降低Mg2+的有效浓度，影响Tag酶的活力，造成浪费。本试验验结果为进一步建立优化、系统的ISSR-PCR反应体系提供了初步的科学数据，利用ISSR分子标记技术对墨兰进行种质资源鉴定、遗传多样性及遗传图谱构建等研究奠定了基础。

参考文献：

[1] 张孟锦，杨志娟兰花育种途径与进展[J]广东农业科学，2008（2）：120～123

[2] 郑万均，傅立国中国植物志[M]第十八卷，1999

[3] Zietkiewicz E，Rafslski A，L abuda DGenome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amp lification[J]Genomics，1994（20）：176～183

[4] 王建波ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J]遗传，2002，24（5）：613～616

[5] 孙正海，王锦，李世峰，等滑叶藤ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]云南农业大学学报，2012，27（5）：746～750

[6] 李爱民，秀麟，陈功锡墨兰解剖学研究[J]热带亚热带植物学报，2002，10（4）：295～300

[7] 刘塔斯，林丽美，龚力民，等分子标记中植物DNA提取方法的研究进展[J]中南药学，2005，3（6）：0370～04

[8] 项艳，於安凤，彭镇华墨兰离体快繁研究[J]林业科学研究，2003，16（4）：434～438

[9] 何正文，刘运生，陈立华正交设计直观分析法优化PCR条件[J]湖南医科大学学报，1998，23（4）：03～404

[10] 刘峰，顾志敏，陈析丰，等长春花ISSR-PCR反应体系的正交优化[J]安徽农业科学，2010，38（5）：2261～2263

[11] 黄执缨墨兰花朵发育和衰老生理的初步研究[J]生物学杂志，2008，20（4）：26～28

[12] 严华，张冬梅，罗玉兰，等38种国兰亲缘关系的ISSR分析[J]分子植物育种，2010，8（4）：736～741

[13] 吴振兴，王慧中，施农农，等兰属植物ISSR遗传多样性分析[J]生物科技，1999，30（5）：627～632

[14] 董如何，肖必华，方永水正交试验设计的理论分析方法及应用[J]安徽建筑工业学院学报：自然科学版，2004，12（6）：103～106

Abstract：In order to establish theISSR-PCR reaction systemofISSR-PCR reactionsystem，this article usesorthogonalexperiment to analyze the influences of fivefactors including Tagenzyme concentration，Mg2+ concentration，DNA templateconcentration，primer concentration，and dNTP concentrationatfourlevelsof the orthogonal teston theCymbidiumISSR-PCRreaction systemThe results show thatwhen Tag enzyme concentrationis 16U/25μl，Mg2+ concentration is 24mmol/L，dNTPconcentration is 096 mmol/L，concentration of primeris 064μmol/L，DNAconcentrationis 80ng/25μl，theISSR-PCRreaction system is optimal

Key words：Cymbidium sinense；ISSR-PCR reactionsystem；optimizationendprint

摘要：为建立墨兰的ISSR-PCR反应体系，采用正交试验分析了5个因素

1引言

墨兰（Cymbidium sinense）花瓣香气浓郁、花色多变、叶形独特，是国兰中株型最大，花茎最长的种类。目前对于墨兰的研究主要集中在形态学、生理学及孢粉学上，而在分子DNA水平上研究很少[1，2]。ISSR是1994年由Zietkiewiczetal提出的一种新型分子标记技术[3]，该技术在SSR（即简单序列重复）技术的基础上有所发展，使实验操作简便且迅速，稳定性好，多态性高，现今在基因定位、遗传作图、遗传多样性、进化以及系统发育等研究中被广泛应用[4]。不同植物对ISSR-PCR反应体系要求不同，因此在利用ISSR标记之前，必须建立该种植物最适ISSR-PCR反应体系。本研究旨在通过正交试验分析模板DNA、TagDNA聚合酶、Primer、Mg2+和dNTPs 5个因子在4个水平上对墨兰ISSR-PCR反应影响，并据此建立墨兰最适ISSR-PCR反应体系，为利用ISSR标记对其进行后续研究奠定基础。

2材料与方法

试验材料墨兰来源于国家林业局保育重点实验室。试验方法包括以下3种。

（1）墨兰基因组DNA提取。采用改良CTAB法[5]提取墨兰基因组DNA。

4结语

采用正交试验分析5个因素（Tag酶浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度）在4个水平上对ISSR-PCR反应的影响，结果表明：Tag酶浓度为16U/25μL、Mg2+浓度为24mmol/L、dNTP浓度096 mmol/L、Primer浓度为064μmol/L、DNA浓度32ng/25μL是墨兰ISSR-PCR最优反应体系。Tag酶用量直接影响扩增反应成功与否，浓度过高造成浪费，但如果Tag酶浓度过低，会导致产物合成效率下降。Mg2+ 浓度主要是通过影响Tag酶活性从而影响PCR反应。dNTP作为PCR反应的原料，浓度太低会使扩增不完全，从而降低PCR产物产量；浓度过高会对Mg2+产生抑制作用，降低Mg2+的有效浓度，影响Tag酶的活力，造成浪费。本试验验结果为进一步建立优化、系统的ISSR-PCR反应体系提供了初步的科学数据，利用ISSR分子标记技术对墨兰进行种质资源鉴定、遗传多样性及遗传图谱构建等研究奠定了基础。

参考文献：

[1] 张孟锦，杨志娟兰花育种途径与进展[J]广东农业科学，2008（2）：120～123

[2] 郑万均，傅立国中国植物志[M]第十八卷，1999

[3] Zietkiewicz E，Rafslski A，L abuda DGenome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amp lification[J]Genomics，1994（20）：176～183

[4] 王建波ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J]遗传，2002，24（5）：613～616

[5] 孙正海，王锦，李世峰，等滑叶藤ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]云南农业大学学报，2012，27（5）：746～750

[6] 李爱民，秀麟，陈功锡墨兰解剖学研究[J]热带亚热带植物学报，2002，10（4）：295～300

[7] 刘塔斯，林丽美，龚力民，等分子标记中植物DNA提取方法的研究进展[J]中南药学，2005，3（6）：0370～04

[8] 项艳，於安凤，彭镇华墨兰离体快繁研究[J]林业科学研究，2003，16（4）：434～438

[9] 何正文，刘运生，陈立华正交设计直观分析法优化PCR条件[J]湖南医科大学学报，1998，23（4）：03～404

[10] 刘峰，顾志敏，陈析丰，等长春花ISSR-PCR反应体系的正交优化[J]安徽农业科学，2010，38（5）：2261～2263

[11] 黄执缨墨兰花朵发育和衰老生理的初步研究[J]生物学杂志，2008，20（4）：26～28

[12] 严华，张冬梅，罗玉兰，等38种国兰亲缘关系的ISSR分析[J]分子植物育种，2010，8（4）：736～741

[13] 吴振兴，王慧中，施农农，等兰属植物ISSR遗传多样性分析[J]生物科技，1999，30（5）：627～632

[14] 董如何，肖必华，方永水正交试验设计的理论分析方法及应用[J]安徽建筑工业学院学报：自然科学版，2004，12（6）：103～106

Abstract：In order to establish theISSR-PCR reaction systemofISSR-PCR reactionsystem，this article usesorthogonalexperiment to analyze the influences of fivefactors including Tagenzyme concentration，Mg2+ concentration，DNA templateconcentration，primer concentration，and dNTP concentrationatfourlevelsof the orthogonal teston theCymbidiumISSR-PCRreaction systemThe results show thatwhen Tag enzyme concentrationis 16U/25μl，Mg2+ concentration is 24mmol/L，dNTPconcentration is 096 mmol/L，concentration of primeris 064μmol/L，DNAconcentrationis 80ng/25μl，theISSR-PCRreaction system is optimal

Key words：Cymbidium sinense；ISSR-PCR reactionsystem；optimizationendprint