马钱子配伍苏木对佐剂关节炎大鼠滑膜组织IL-1β、IL-6及IL-10的影响

孙响波，于妮娜，杨子东，唐迎雪

（1.山东中医药大学2012级博士研究生，山东 济南 250014；2.山东中医药大学2012级硕士研究生，山东 济南 250014；

3.山东中医药大学研究生处，山东 济南 250355）

类风湿性关节炎（RA）是与环境、细胞、病毒、遗传、免疫、性激素及神经精神状态等因素密切相关的疾病。研究证实，RA患者滑膜细胞及滑膜组织中浸润的单核/巨噬细胞、淋巴细胞等通过自分泌或旁分泌的方式产生大量的细胞因子和炎性介质，参与RA的致病过程。IL-1、IL-6、LI-10等在RA的发病中具有促炎、抑炎或刺激、抑制正负反馈免疫调控作用［1］。在RA活动期，滑膜中的IL-1β、IL-6等致炎性细胞因子升高，自身产生抑制性细胞因子以减轻炎症反应；在体内，IL-10是最主要的抑炎性细胞因子，主要由单核/巨噬细胞、T细胞等分泌，通过抑制单核巨噬细胞的激活、迁移与粘附及炎症因子的合成与释放，减轻全身及关节局部炎症反应。马钱子性温味苦，有大毒，功能活血逐瘀，通络止痛，其性猛烈，善于疏通走窜，功捷效强。临床多用于风湿痹痛，肢体瘫痪等顽疾的治疗。苏木性平，味甘、咸、微辛，无毒，归心、肝、脾经。具活血祛瘀，消肿止痛之功。主治血滞经闭、跌打瘀痛、痈肿疮毒等。临床多用于风湿痛，膝关节肿胀，腰腿痛，足跟痛，骨折疼痛等病的治疗。我们用马钱子配伍苏木（简称马苏）对佐剂关节炎（AA）大鼠滑膜中 IL-1β、IL-6、IL-10含量的影响，探讨马苏配伍后的抗炎机制并寻求最佳配比，报道如下。

1 材 料

中药材：马钱子，为马钱科植物马钱Strychnos.nuxvomica L.的成熟种子。以砂烫炮制。苏木，为豆科植物苏木Caesalpinia sappan L.的心材。以上中药材购于山东中医药大学中鲁医院，经本校中药鉴定教研室李峰老师鉴定，符合2010版《中国药典》标准。

制剂制备：①马钱子单煎剂：称取马钱子20g，加8倍量（以质量计）蒸馏水，浸泡1h，武火煮沸30min，用双层纱布过滤，得滤液I；药渣再加6倍量蒸馏水，武火煮沸20min，同上法过滤，得滤液II；合并滤液I，II，65℃恒温水浴浓缩至每毫升制剂含马钱子0.25g，灭菌，4℃冰箱保存备用。②马钱子配伍苏木1∶6煎剂：称取马钱子20g，苏木120g，加8倍量（以质量计）蒸馏水，浸泡1h，武火煮沸30min，用双层纱布过滤，得滤液I；药渣再加6倍量蒸馏水，武火煮沸20min，同上法过滤，得滤液II；合并滤液I，II，65℃恒温水浴浓缩至1mL制剂含马钱子0.25g，灭菌，4℃冰箱保存备用。③马苏1︰12、1︰18、1︰24煎剂：制备方法同上。

试剂：0.3%戊巴比妥钠（分析纯，批号1D08062311，山东齐都药业有限公司），冰乙酸（分析纯，批号20080626，莱阳市康德化工有限公司），无水乙醇（批号20080521，莱阳市康德化工有限公司），弗氏完全佐剂（批号038K8726 CAS9007-81-2，美国Sigma公司），IL-1β测试盒（批号28C037，美国R&D公司），IL-6测试盒（批号46E029，美国R&D公司），IL-10测试盒（批号12A021，美国R&D公司）。

仪器：电热恒温水浴箱（SSW，上海博迅实业有限公司），快速混匀器（SZ-1，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂），外径千分尺（沪00000315，上海永鑫工量具有限公司），全自动高速冷冻离心机（GL20A，湖南仪器仪表总厂离心机厂），超低温冰箱（UltraFreeze，丹麦Heto公司），上皿电子天平（JA5003，上海精科天平厂），全自动酶标仪（EL340i，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司）。

动物：SPF级Wistar大鼠，体质量（200±20）g，雌雄各半，山东鲁抗医药股份有限公司提供，许可证号SCXK（鲁）20110015。

实验结果用SPSS17.0统计软件，采用One-way ANOVA进行统计分析，各组实验数据以均数±标准差（）表示，均以P<0.05为具有统计学意义。

2 方 法

取Wistar大鼠91只，取其中70只，雌雄各半，按体质量、性别随机分为7组，每组10只，分别为空白组、模型组、马钱子单煎剂组、马钱子配伍苏木1∶6、1∶12、1∶18、1∶24煎剂组。另21只大鼠做好标记，3只为一组，分别置于上述7组中（用于做滑膜组织病理切片）。造模方法参照文献［2］，从实验开始第1天，除正常组外，其余各组大鼠分别从每只大鼠右后足垫部皮下注入弗氏完全佐剂（Freund's Complete Adjuvant，FCA）0.1mL（0.25mL注射器，专人注射，保持剂量准确及部位一致），建立AA大鼠模型。实验从第32天的21:00禁食不禁水12h，第33天全部大鼠称重，用水合氯醛腹腔注射麻醉0.01mL/g，取滑膜。

取滑膜组织，在下右膝关节打开膝关节腔，沿膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出以膝关节为中心约3cm×3cm区域，用有齿镊提起髌骨，沿髌骨上沿约0.3～0.4cm处向下切至股骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨，由髌骨下极向上延续有一层平滑光亮呈淡黄色的滑膜组织，完整剥离滑膜组织，用刀片完整切下。称重后以1.5mL生理盐水于冰浴中匀浆滑膜组织，将匀浆液2000rpm离心10min，取上清液待测。

3 结 果

马钱子配伍苏木对AA大鼠滑膜组织IL-1β、IL-6含量的影响见表1。

表1 马钱子配伍苏木对AA大鼠滑膜组织中IL-1β、IL-6含量的影响（）

表1 马钱子配伍苏木对AA大鼠滑膜组织中IL-1β、IL-6含量的影响（）

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与马钱子单煎剂组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

△马苏1∶24煎剂 10 110.0 0.251±0.091* 69.571±42.176*

马钱子配伍苏木对AA大鼠滑膜组织中IL-10含量的影响见表2。

表2 马钱子配伍苏木对AA大鼠滑膜组织中IL-10含量的影响 （）

表2 马钱子配伍苏木对AA大鼠滑膜组织中IL-10含量的影响 （）

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与马钱子单煎剂组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

组别 动物数（只） 剂量（mg/kg） IL-10（pg/mL）空白组 10 - 141.208±16.132模型组 10 - 102.125±21.314马钱子单煎剂 9 110.0 109.347±20.246马苏1∶6煎剂 10 110.0 113.261±19.077*马苏1∶12煎剂 9 110.0 120.721±22.534*马苏1∶18煎剂 10 110.0 127.216±19.359**△马苏1∶24煎剂 10 110.0 106.103±18.638

4 讨 论

滑膜是一层具有丰富血管的结缔组织，是血管丰富的关节囊内膜，由平滑光亮、粉红色、薄而柔润的疏松结缔组织构成，内含有胶原性纤维，紧贴关节囊纤维层的内面，附着于关节软骨的周缘。RA的病理过程中，伴随着滑膜细胞增生，会出现滑膜组织增厚，关节粘连等病理改变，尽管许多炎性细胞因子和炎性介质参与了这个病理过程，但滑膜细胞增生仍是这一病理过程的最直接反应。马钱子与苏木配伍后可协同增效，降低毒性。IL-1β是RA软骨损伤的主要原因之一，在慢性类风湿关节炎发病中，IL-1促进关节滑膜过量产生前列腺素和胶原酶，破坏软骨组织，活化破骨细胞，促进骨吸收。关节腔内有IL-1存在与发病的严重程度正相关。IL-6是一种多功能的细胞因子，可由淋巴细胞及非淋巴细胞产生，在调节免疫应答、急性期反应、促进骨髓造血等方面均具有重要作用。RA患者的炎性滑膜可释放一些细胞因子，刺激破骨细胞释放酸性蛋白水解酶，从而导致骨吸收和软骨钙化增加［3］。IL-6还能诱导其他细胞因子如IL-1、IL-2和TNF-α等产生及释放，并且增强了IL-1和TNF-α等炎症的破坏作用［3］。IL-10是RA病变过程中起保护作用的重要细胞因子，由TH2产生，能够促进抗体产生、促进肥大细胞和嗜酸性粒细胞的增殖与分化、抑制单核细胞因子（如IL-1、TNF-α）的产生。研究证实其作用机制可能与抑制滑膜巨噬细胞和T细胞合成炎性因子有关。马苏的不同浓度组的抗炎作用可能与其抑制炎性因子的产生与释放密切相关，在不同程度上减慢或阻断炎性细胞因子的致炎效应，使血清中的炎性细胞因子含量呈现下降趋势，通过下降异常分泌增多的IL-1β、IL-6以及升高保护性因子IL-10进而减轻AA大鼠炎症反应，加速炎性细胞因子的清除，以抑制滑膜细胞的增生以及B细胞、T细胞等异常激活，来减轻滑膜细胞的炎症反应和骨组织破坏和吸收，中断AA大鼠的病理进程，继而影响炎症的发生、发展，达到抗炎消肿的目的。

［1］姚航平，徐建忠，张立煌.类风湿关节炎患者血清滑液和滑膜组织白细胞介素-18的水平及意义［J］.中华风湿病学杂志，2002，2（3）：12.

［2］CHOY E Clinical experience with inhibition of interleuk in-6［J］.Rheum D is Clin North Am，2004，30（2）：405-415.

［3］Einhorn TA.Neutral proteases in regenerating bone［J］.Clin Orthop，1991，262：286.