通过性腺形状和颜色鉴定红鳍东方鲀的性别

孙赛红+王玉芳+姜志强+仇雪梅+王秀利

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.02.004

摘 要：：随机采集体长18～20 cm、体重200～250 g的红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）44尾，解剖观察并记录性腺组织外观，然后利用组织切片技术鉴定个体的性别。结果表明：性腺为细长条状且呈乳白色的个体为雄性个体，而性腺为袋状且呈淡红色的个体为雌性个体，且样本群体中的雌雄性别比例为1∶1。本研究结果为通过性腺外观形状和颜色即可准确鉴定体长为20 cm左右的红鳍东方鲀的性别提供了参考依据。

关键词：红鳍东方鲀；性别鉴定；性腺形状和颜色；组织切片技术

红鳍东方鲀 主要分布于中国的黄渤海和日本海。由于其特殊的营养价值和鲜美的味道，红鳍东方鲀一直深受中国、日本和韩国等人民的喜爱[1]。近年来，人们不断开发利用红鳍东方鲀，对它的研究也越来越多样化。

性别鉴定技术在红鳍东方鲀乃至整个鱼类的种群资源保护和增养殖方面具有重要作用。目前性别鉴定的方法主要有荧光原位杂交（FISH）、组织切片技术、多聚酶链式反应（PCR）和AFLP分子标记等，它们已在哺乳动物和鱼类的性别鉴定中得到了广泛的应用。部分养殖鱼类的生物学性状（如成熟年龄、繁殖方式、体色、体型、个体大小）在雌雄鱼之间存在较大差异，便于区分。然而，在非繁殖季节，红鳍东方鲀却没有明显的雌雄外部特征，所以，对其雌雄的鉴别以及性腺发育阶段的区分较为困难。尤其对于某些研究，例如对于需做红鳍东方鲀不同性别不同组织器官的差异表达等研究时，前述的分子生物学方法的过程略显繁琐，故急需找到更简单、明了、准确的性别判定法。通过观察发现，对于非繁殖季节的红鳍东方鲀，其性腺外观一种表现为袋状，且颜色淡红，而另一种表现为长条状，呈乳白色。本研究采用组织切片技术[2]进行分析以发现雌雄性腺外观的客观差别和规律。

1 材料和方法

1.1 试验材料

红鳍东方鲀采自大连天正实业有限公司，共采集44尾。体长为18～20 cm，体重为200～250 g。

1.2 试剂

无水乙醇、二甲苯、苦味酸、甲醛、酸水、碱水、苏木精伊红染液、甘油蛋白、中性树胶、高级切片石蜡等试剂和药品来自大连海洋大学基因工程实验室。

1.3 仪器

烘箱、切片机（LEICA RM 2235）、显微镜（LEICA DM 2000）和烘片机（LEICA HI 1220）等。

1.4 方法

解剖红鳍东方鲀，观察性腺形状和颜色。按丛玉婷、唐洪玉、梁春光和戴奇等[2-5]方法制作组织切片。

1.4.1 固定、脱水、透明 取性腺于bouin氏固定液中固定24 h后，每隔2 h、4 h、6 h、12 h、24 h换一次70%乙醇，洗去渗入组织内部的固定剂；然后将洗涤好的样品用酒精梯度（70%、80%、90%、95%、100%）依次脱水，每次35～45 min，除去组织内含有的大量水分；1/2无水乙醇和1/2二甲苯作用30 min，二甲苯作用15 min置换出组织内的脱水剂至组织块完全透明。

1.4.2 包埋、渗蜡、切片 石蜡融化后，将组织块置于含1/2二甲苯和1/2石蜡的小瓶子渗透30 min，然后在纯石蜡中渗透40 min，纯石蜡再次渗透30 min；将纸片叠成盒状，倒上融化好的石蜡，然后把渗好蜡的组织块放入盒中间，待蜡凝固；把凝固的蜡块修成适合大小，固定于切片机上，切片；取较好的切片挑在事先涂少许甘油蛋白和蒸馏水的载玻片上展片，于烘干机上烘干水分。

1.4.3 染色 首先脱蜡，二甲苯脱蜡15 min，换新的二甲苯再次脱蜡15 min；然后降水，100%乙醇 I、100%乙醇 II、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、H2O依次降水2 min；苏木精染液着色10 min，自来水冲洗5 min；1%盐酸酸化5 s，水洗3 min；1%氨水蓝化5 s，水洗3 min；脱水：30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇依次脱水2 min；伊红染色液着色5 min；95%乙醇、100%乙醇 I、100%乙醇 II脱水2 min；二甲苯透明10 min，换新的二甲苯透明10 min。

1.4.4 封片、观察 将透明结束的载玻片从二甲苯中取出，在切片中央滴一滴中性树胶，然后用镊子轻轻盖上盖玻片，避免产生气泡，于LEICA DM 2000显微镜下观察红鳍东方鲀性腺内部结构。

2 结果

通过对44尾红鳍东方鲀性腺外观的观察，发现其性腺形状和颜色可分为两种：一种为袋状淡红色，见图1；另一种为长条状乳白色，见图2。它们对应的组织切片结果分别为图3和图4。图3为红鳍东方鲀处于第Ⅱ期的卵巢切片，此时初级卵母细胞处于小生长期，细胞质为嗜碱性，细胞核中核仁靠近核膜内侧分布[6]。图4为雄鱼的精巢切片，图中可明显看到精母细胞和染成深色的精子[6]。本研究有22尾鱼的性腺外观表现为袋状、淡红色，为雌性个体；22尾鱼的性腺外观表现为长条状、乳白色，为雄性个体。红鳍东方鲀的雌、雄性别比例为1∶1。

图1 袋状淡红色性腺

图2 长条状乳白色性腺

图3 雌性性腺组织切片

图4 雄性性腺组织切片

3 讨论

早期的性别鉴定法主要是染色体核型分析法、组织切片法、H-Y抗原检测法和X染色体酶活性检测法等[7]。20世纪80年代后期，分子生物学方法开始应用于哺乳动物胚胎性别的鉴定，其具有很高的灵敏度和准确度[8]。随着鱼类性别决定相关基因如DMY、DMRT1、SOX、Tra2等[9-10]基因的发现，鱼类分子生物学性别鉴定技术也相继发展起来，有多聚酶链式反应（PCR）扩增雄性染色体特异基因、荧光原位杂交（FISH）和随机扩增多态性DNA（RAPD）等[11-13]方法。

通过观察发现，对于非繁殖季节的红鳍东方鲀，其性腺外观有两种：一种为袋状淡红色，另一种为长条状乳白色，推测具有袋状淡红色性腺的个体为雌性个体，具有长条状乳白色性腺的个体为雄性个体。本研究采用组织切片技术进行分析鉴定此客观差别和规律。利用组织切片法已对牙鲆、斑马鱼、暗纹东方鲀、石鲽、长江刀鲚、黄颡鱼、大弹涂鱼、半滑舌鳎等鱼的性腺发育过程进行了研究。潘彬斌[14]用组织切片法观察三角帆蚌性腺各时期发育；王晶等[15]利用组织切片法研究斑马鱼性腺发育过程，找到了斑马鱼的性别分化和性腺分化过程；王文君等[16]用组织切片法观察了石鲽仔、幼鱼性腺发育过程。这些研究都表明利用组织切片的方法可清晰辨别性腺类型，即通过组织切片得到的实验结果是准确可靠的。本研究利用组织切片技术证明了体长20 cm左右的红鳍东方鲀性腺为袋状淡红色的个体全部为雌性个体，性腺为长条状乳白色的个体全部为雄性个体。对于需要采集体长为20 cm左右的红鳍东方鲀不同的组织器官进行相关研究，又需要知道准确的性别来讲，今后可通过解剖观察其性腺的形状和颜色，即可准确判定其雌或雄的性别，不必再用其他任何方法进行鉴定。通过解剖观察性腺的形状和颜色判定性别，该方法简单、明了、准确。

参考文献：

[1] 马爱军，陆丽君，陈超，等．东方鲀属主要经济鱼种繁育养殖、育种和基因研究现状[J]．海洋科学，2011，35(11)：128-130

[2]丛玉婷．生物切片技术[M]．大连：大连理工大学出版社，2011：10

[3]唐洪玉，陈大庆，史建全，等．青海湖裸鲤性腺发育的组织学研究[J]．水生生物学报，2006，30(2)：166-170

[4]梁春光，康现江，李凤超，等．半滑舌鳎性腺的组织学研究[J]．河北渔业，2007(11) ：22-24

[5]戴奇．暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）性腺分化的组织学及芳香化酶基因（CYP19A）表达的研究[D]．华东师范大学，2010，5：14-17

[6]楼允东．组织胚胎学[M]．北京：中国农业出版社，2000：299-312

[7]唐雪峰，李建柱．哺乳动物胚胎性别鉴定技术的研究进展[J]．河南畜牧兽医，2006，27(3)：11-12

[8]马志君，陈祥，张勇，等．哺乳动物胚胎性别鉴定技术的研究进展[J]．贵州农业科学，2007，35(2)：116-120

[9]Kikuchi K，Kai W，Hosokawa A，et al．The sex-determining locus in the tiger pufferfish, Takifugu rubripes． Genetics， 2007，175(4)：2041

[10]尚晓莉，曲宪成．鱼类性别决定和性别分化机制研究进展[J]．农业科学，2010(4)：245-330

[11]李云航，孙鹏．鱼类性别决定机制及性别相关基因研究进展[J]．现代渔业信息，2011，26(12)：11-13

[12] Rens W，Yang F， Welch G， et al． Fergu son Smith MA.An X-Y paint set and sperm FISH protocol that can be used for validation of cattle sperm separation procedures．Reproduction，2001，121(4)：541-6

[13] Giménez C，Egozcue J．Vidal F.Sexing sibling mouse blastomeres by polymerase chain reaction and fluorescent in-situ hybridization．Hum Reprod， 1994 ，9(11)：2145-9

[14]潘彬斌．池养三角帆蚌性腺发育组织学研究[D]．上海：上海海洋大学，2010

[15]王晶，王冰，李纪同，等．斑马鱼性腺发育的组织学观察[J]．基因组学与应用生物学，2011，30(2) ：168-174

[16]王文君，王开顺，邵明瑜，等．石鲽仔、幼鱼性腺发育的组织学观察[J]．中国水产科学，2007，14(5) ：843-845

Sex identification by gonad shape and color in Takifugu rubripes

SUN Sai-hong，WANG Yu-fang，JIANG Zhi-qiang，QIU Xue-mei，WANG Xiu-li

（College of Fisheries and Life Sciences,Dalian Ocean University,Dalian 116023）

Abstract：44 Takifugu rubripes individuals of 18～20 cm body length and 200～250 g body weight were sampled randomly. The gonad of each individual was collected and its shape and color was recorded at the same time. Histological section technique was used to determinate the gender of Takifugu rubripes. The results showed that the individuals with bursiform pink gonads were females, the individuals with spindly lacte gonads were males. And the ratio in the sample between males and females was 1:1. The results could provide the evidence and reference for sex determination according to observe the gonad shapes and color in Takifugu rubripes which was nearly 20 cm in body length.

Key words：Takifugu rubripes；sex identification；gonad shape and color；histological section technique

（收稿日期：2013-12-04）

参考文献：

[1] 马爱军，陆丽君，陈超，等．东方鲀属主要经济鱼种繁育养殖、育种和基因研究现状[J]．海洋科学，2011，35(11)：128-130

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[14]潘彬斌．池养三角帆蚌性腺发育组织学研究[D]．上海：上海海洋大学，2010

[15]王晶，王冰，李纪同，等．斑马鱼性腺发育的组织学观察[J]．基因组学与应用生物学，2011，30(2) ：168-174

[16]王文君，王开顺，邵明瑜，等．石鲽仔、幼鱼性腺发育的组织学观察[J]．中国水产科学，2007，14(5) ：843-845

Sex identification by gonad shape and color in Takifugu rubripes

SUN Sai-hong，WANG Yu-fang，JIANG Zhi-qiang，QIU Xue-mei，WANG Xiu-li

（College of Fisheries and Life Sciences,Dalian Ocean University,Dalian 116023）

Abstract：44 Takifugu rubripes individuals of 18～20 cm body length and 200～250 g body weight were sampled randomly. The gonad of each individual was collected and its shape and color was recorded at the same time. Histological section technique was used to determinate the gender of Takifugu rubripes. The results showed that the individuals with bursiform pink gonads were females, the individuals with spindly lacte gonads were males. And the ratio in the sample between males and females was 1:1. The results could provide the evidence and reference for sex determination according to observe the gonad shapes and color in Takifugu rubripes which was nearly 20 cm in body length.

Key words：Takifugu rubripes；sex identification；gonad shape and color；histological section technique

（收稿日期：2013-12-04）

参考文献：

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[15]王晶，王冰，李纪同，等．斑马鱼性腺发育的组织学观察[J]．基因组学与应用生物学，2011，30(2) ：168-174

[16]王文君，王开顺，邵明瑜，等．石鲽仔、幼鱼性腺发育的组织学观察[J]．中国水产科学，2007，14(5) ：843-845

Sex identification by gonad shape and color in Takifugu rubripes

SUN Sai-hong，WANG Yu-fang，JIANG Zhi-qiang，QIU Xue-mei，WANG Xiu-li

（College of Fisheries and Life Sciences,Dalian Ocean University,Dalian 116023）

Abstract：44 Takifugu rubripes individuals of 18～20 cm body length and 200～250 g body weight were sampled randomly. The gonad of each individual was collected and its shape and color was recorded at the same time. Histological section technique was used to determinate the gender of Takifugu rubripes. The results showed that the individuals with bursiform pink gonads were females, the individuals with spindly lacte gonads were males. And the ratio in the sample between males and females was 1:1. The results could provide the evidence and reference for sex determination according to observe the gonad shapes and color in Takifugu rubripes which was nearly 20 cm in body length.

Key words：Takifugu rubripes；sex identification；gonad shape and color；histological section technique

（收稿日期：2013-12-04）