低氧对脂肪间充质干细胞向雪旺细胞分化的影响

陈鸥 胡旭琪 郑旭浩 蒋良福

雪旺细胞(Schwann cells，SCs)在周围神经再生中能发挥修复作用，广泛应用于组织工程。但自体SCs 来源有限，增殖能力低，培养周期长，难以满足组织工程需要［1］，而使用异体SCs 又存在免疫排斥问题。脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)有多向分化能力，目前大量研究发现ADMSCs 经诱导可分化为SCs，并能应用于去细胞异体神经移植，发挥外周神经修复作用［1-3］。但是，去细胞异体神经是一种无血供的移植物，早期不能及时建立血液循环，从而造成了低氧微环境。大部分研究认为间充质干细胞在低氧环境中存活率很低，低氧时3 ～4 d 内就会死亡［4-5］。本研究模拟体内低氧环境，探讨低氧对ADMSCs 向SCs 分化能力的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

Ⅰ型胶原酶、全反式维甲酸、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、胰岛素、吲哚美辛及IBMX 均购自美国Sigma 公司。胎牛血清、DMEM/F12 培养基及青链霉素均购自美国Gibco 公司，β-巯基乙醇购自美国Amresco 公司。腺苷酸环化酶激活剂、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子及神经胶质生长因子均购自英国Peprotech 公司。兔抗大鼠CD44 抗体、兔抗大鼠CD45 抗体及兔抗大鼠CD90 抗体均购自美国Biolegend 公司。兔抗大鼠S-100抗体、兔抗大鼠GFAP 抗体均购自美国Abcam公司，兔抗大鼠GAPDH 抗体购自美国Proteintech Group 公司。茜素红、油红O 购自浙江天杭生物科技有限公司。MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、DAPI、RIPA 细胞裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、DAB 显色试剂盒、羊抗兔Ig G 二抗及TBST 缓冲液均购自上海碧云天生物技术有限公司。CX41 倒置显微镜、BX51荧光显微镜均购自日本奥林巴斯公司。FACS Aria流式细胞仪购自美国BD 公司。ELX808 酶联免疫检测仪购自美国Bio-Tek 公司。ChemiDocTMMP 凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad 公司。

1.2 大鼠ADMSCs 的分离

选取清洁级雄性近交系SD 大鼠10 只(购自温州医学院实验动物中心)，体质量180 ～200 g，2 月龄。参照参考文献［6］从大鼠脂肪组织提取ADMSCs 的方法并加以改良，分离ADMSCs:大鼠麻醉后取双侧睾丸周围脂肪组织，去除肉眼可见血管，剪成1 mm×1 mm ×1 mm 大小方块，0.1% Ⅰ型胶原酶震荡消化60 min，等体积DMEM/F12 终止消化。200 目细胞筛过滤，200 ×g 离心10 min，去上清液。用含15%胎牛血清的DMEM/F12 重悬沉淀并接种于25 cm2培养瓶中，5% CO2、37 ℃培养箱培养。48 h 后换液并去除未贴壁细胞，以后每3 天换液1 次。细胞汇合度达80%时用0.25%胰酶消化传代。

1.3 大鼠ADMSCs 的鉴定

选取传代后的第3 代细胞置于倒置显微镜下观察细胞形态。流式细胞仪鉴定CD44、CD45 和CD90等细胞表面标志:0.25%胰酶消化细胞，加入100 μL PBS 缓冲液洗涤细胞，1000 r/min (离心半径18 cm)，离心5 min，去上清。分别加入兔抗大鼠CD44、CD45 和CD90 抗体2 μL，室温避光孵育30 min，加入100 μL PBS 缓冲液洗涤去除多余抗体，上机检测。成骨、成脂能力的鉴定:细胞经成骨诱导培养基(含0.1 μmol/L 地塞米松，50 μg/mL 抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠)诱导2 周及成脂诱导培养基(含1 μmol/L 地塞米松，200 μmol/L 吲哚美辛，0.5 μmol/L IBMX，10 mg/L 胰岛素)诱导2 周后，分别用茜素红染色以及油红O 染色。

1.4 分组和诱导

选取传代后的第3 代细胞按1 ×104/mL 接种于25 cm2培养瓶中，细胞汇合度达80%后，将细胞随机分成3 组。(1)常氧诱导组:于5% CO2、21% O2、37 ℃条件下诱导。诱导时加入含1 mmol/L β-巯基乙醇的DMEM/F12 培养液诱导，24 h 后去除培养液，PBS 缓冲液清洗，加入含40 ng/mL 全反式维甲酸的DMEM/F12 培养液诱导，72 h 后去除培养液，PBS 缓冲液清洗，加入含5 ng/mL 血小板源性衍生因子、10 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、14 μmol/L 腺苷酸环化酶激活剂、200 ng/mL 神经胶质生长因子的DMEM/F12 培养液诱导14 d，每3 天换液1 次。(2)低氧处理+常氧诱导组:先将细胞培养于5% CO2、0.5% O2、37 ℃培养箱中24 h［7］，随后转移至5% CO2、21% O2、37 ℃条件下诱导，诱导方式同常氧诱导组。(3)低氧诱导组:于5% CO2、0.5% O2、37 ℃条件下诱导，诱导方式同常氧诱导组。诱导完成后倒置显微镜下观察细胞形态学变化。

1.5 MTT 法检测各组细胞增殖情况

诱导结束后，0.25%胰酶消化各组细胞并以1 ×103个/孔的密度接种于96 孔板，每孔200 μL，使用含15% 胎牛血清的DMEM/F12 培养液继续培养24 h。随后每孔加入20 μL MTT 试剂，同时设空白调零孔，孵育4 h。加入MTT 溶解液150 μL，低速振荡10 min，酶联免疫检测仪读取570 nm 波长处A 值。

1.6 免疫荧光染色检测GFAP 和S-100 表达

各组细胞完成诱导后，制备细胞爬片，4%多聚甲醛固定。羊血清封闭非特异性位点，分别滴加兔抗大鼠GFAP 抗体(1 ∶300)与兔抗大鼠S-100 抗体(1 ∶100)，4 ℃孵育过夜，滴加荧光标记的羊抗兔lg G 二抗，常温孵育1 h，用DAPI 对细胞核染色后在荧光显微镜下观察。

1.7 Western blot 检测GFAP 和S-100 表达

收集诱导后的细胞，加入RIPA 细胞裂解液，提取细胞内蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。配制5%浓缩胶和10%分离胶进行SDS-PAGE 电泳，电泳分离蛋白后，将蛋白条带电转移至PVDF 膜。5% 脱脂奶粉封闭，分别加入兔抗大鼠GFAP 一抗(1 ∶300)、兔抗大鼠S-100 一抗(1 ∶100)以及兔抗大鼠GAPDH 一抗(1 ∶8 000)，37 ℃孵育2 h，TBST 洗膜3 次，5 min/次。加入羊抗兔IgG 二抗(1 ∶5 000)，室温孵育1 h，TBST 缓冲液洗膜3 次，DAB 显色试剂盒进行显色。ChemiDocTMMP 凝胶成像分析系统分析各组蛋白条带。

1.8 统计学方法

采用SPSS13.0 统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差()表示，多组间ADMSCs增殖情况比较采用单因素方差分析。以P ＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 ADMSCs 鉴定结果

倒置显微镜观察可见分离后的细胞贴壁生长，呈成纤维细胞样，符合间充质干细胞的形态学特点。流式细胞仪鉴定细胞表面标记发现:细胞表面CD44和CD90 表达阳性，而造血干细胞相关标志物CD45表达阴性(图1)。成骨及成脂诱导培养基诱导2 周后，细胞茜素红染色(图2)及油红O 染色(图3)阳性，提示该细胞具有ADMSCs 表型及多向分化能力，证明ADMSCs 分离培养成功。

2.2 诱导后的ADMSCs 形态学观察

常氧诱导组、低氧处理+常氧诱导组ADMSCs在诱导14 d 后，可见细胞呈梭形生长，出现有光晕的突起，相邻细胞突起之间相互连接，呈树杈状排列，可见两极突起。低氧诱导组ADMSCs 在诱导14 d后，可见大量细胞呈成纤维细胞样生长，出现较圆钝、无明显光晕的突起，未见两极突起(图4)。提示常氧诱导组、低氧处理+常氧诱导组细胞在诱导后出现SCs 形态学表现，低氧诱导组细胞未出现SCs 形态学表现。

图1 流式细胞仪检测脂肪间充质干细胞表面CD44、CD45、CD90 表达

图2 脂肪间充质干细胞经成骨诱导培养基诱导2 周后茜素红染色阳性(×100)

图3 脂肪间充质干细胞经成脂诱导培养基诱导2 周后油红O 染色阳性(×100)

图4 各组脂肪间充质干细胞的形态学观察(×100)

2.3 各组ADMSCs 的增殖情况

MTT 法检测结果显示，低氧处理+常氧诱导组A 值为0. 861 ±0. 039，高于常氧诱导组0. 837 ±0.017，差异具有统计学意义(P ＜0.05)。低氧诱导组A 值为0.931±0.041，均高于常氧诱导组和低氧处理+常氧诱导组，差异有统计学意义(P 均＜0.05)。提示低氧环境可以造成ADMSCs 增殖能力增强。

2.4 各组ADMSCs GFAP 和S-100 的表达情况

免疫荧光染色结果显示，常氧诱导组和低氧处理+常氧诱导组大量ADMSCs GFAP 和S-100 表达阳性，低氧诱导组仅少量ADMSCs GFAP 和S-100表达阳性(图5 ～6)。Western blot 检测发现常氧诱导组S-100 蛋白表达最高，低氧处理+常氧诱导组GFAP 蛋白表达最高，低氧诱导组S-100 蛋白、GFAP蛋白表达最低(图7 ～8)。

3 讨 论

ADMSCs 与骨髓间充质干细胞有相似的干细胞表型，均具有多向分化能力，能向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞等成体细胞分化，还可以向SCs 分化并具有SCs 的功能［6，8-9］。Kingham 等［9］发现体外分化形成的SCs 与NG-108 细胞共培养后，能促进神经轴突的生长。Rosova 等［10］研究认为体内环境氧浓度约为1% ～7%，与体外培养环境供氧条件有明显的差别，细胞外氧浓度是影响细胞生物学功能的重要因素，低氧浓度影响间充质干细胞的增殖和分化。本研究发现，低氧诱导组ADMSCs 增殖能力最高，低氧处理+常氧诱导组ADMSCs 增殖能力高于常氧诱导组，提示低氧环境能促进诱导后的ADMSCs 增殖。Grayson 等［11-12］通过体外培养人骨髓间充质干细胞发现，低氧能促进其增殖能力，提高干细胞标志性基因表达水平，这与本研究结果较为一致。Valorani 等［13］研究表明，低氧培养虽然缩短间充质干细胞分裂时间，但会降低其分化能力。其可能的机制为:(1)低氧激活ERK1/2、P38 有丝分裂原激活蛋白激酶及PI3K/Akt 信号通路，增强细胞再生能力;(2)低氧抑制Wnt 信号通路和骨形态发生蛋白信号通路;(3)低氧会提高低氧诱导因子2α的表达，进而上调Oct-4 的表达，而Oct-4 是维持间充质干细胞多向分化特性和自我更新的关键基因［14-15］。

图5 荧光显微镜下各组脂肪间充质干细胞GFAP 表达情况(免疫荧光染色，×200)

图6 荧光显微镜下各组脂肪间充质干细胞S-100 表达情况(免疫荧光染色，×200)

图7 各组脂肪间充质干细胞GFAP 蛋白条带及条带灰度值

图8 各组脂肪间充质干细胞的S-100 蛋白条带及条带灰度值

GFAP 是一种中间丝蛋白，S-100 是一种酸性钙结合蛋白，二者均在SCs 中大量表达，是SCs 的重要标记物。本研究中，常氧诱导组和低氧处理+常氧诱导组的GFAP 和S-100 蛋白表达明显高于低氧诱导组，表明低氧环境抑制ADMSCs 向SCs 分化，但经过低氧预处理的ADMSCs 在恢复正常氧浓度状态下可继续向SCs 分化。低氧抑制ADMSCs 向SCs 分化的机制尚待进一步研究。

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