牛磺酸合用维生素C上调KATP通道mRNA表达对长期饮酒大鼠脑损伤的保护作用

李怡欣，王 凯，陈 敏，李 洁，张明升，赵 青，张轩萍

长期大量饮酒会出现躯体或心理症状，不仅造成全身多器官损害，对脑损伤尤其严重［1］，尸检发现27%长期饮酒者显示小脑变形［2］。酒精中毒后会引起脑血管自身的病变而减少脑血流，造成缺血缺氧改变，导致氧化应激反应和自由基损害组织和细胞［3］。

脑组织如海马、黑质、纹状体、苍白球和小脑等部位均有高密度的ATP敏感性钾通道（ATP－sensitive K＋channels，KATP通道）存在，这些脑区的神经元对缺血缺氧损伤十分敏感［4］。缺氧、代谢毒物均可使KATP活化［5］，通过保持细胞内外钾离子的浓度平衡、减轻细胞内钙超载、扩张血管、减少ATP消耗等作用对大脑起保护作用［6］。KATP通道在酒精性脑损伤中的作用如何，抗氧化治疗能否通过KATP通道发挥保护脑组织的作用未见相关报道。本实验拟建立大鼠长期饮酒模型，观察抗氧化治疗对脑组织的保护作用是否有KATP通道参与，为防治酒精性脑损伤提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 维生素C（Vitamin C），太原市振兴制药有限公司，批号：20100919。牛磺酸（Taurine），南京制药厂，批号：980923。50度北京二锅头酒由北京皇家京都酒业有限公司生产；无水乙醇由天津市大茂化学试剂厂生产。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）试剂盒购自南京建成科技有限公司；E.Z.N.A.Tussue RNA Kit总RNA抽提试剂盒（OMEGA BIO－TEK）。RT－PCR二步法试剂盒（宝生物工程大连有限公司，－20℃保存）。

1.2 仪器与设备 721可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；JY 600电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；天能凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；MJ Research PTC 100 Thermal Cycler（Waltham，MA，USA）。

1.3 实验动物 Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠50只，体重200g～220g，由郑州大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（豫）2005－0001。所有大鼠23℃～25℃室内饲养，自由饮水或饮酒，自由摄食。动物随机分为5组，分别为空白对照组（C组）、酒精组（A组）、维生素C组（V组）、牛磺酸组（T组）、维生素C＋牛磺酸组（V＋T组），每组10只。C组大鼠自由饮水；其余各组大鼠自由饮用白酒［10%（V／V）酒精1周，之后给予20%（V／V）酒精19周，共20周］；V组大鼠在饮酒同时加0.05%维生素C；T组大鼠在饮酒同时加2%牛磺酸；V＋T组大鼠在饮酒同时加0.05%维生素C和2%牛磺酸。

1.4 大鼠脑组织生化指标测定 模型建立20周后，按4mL／kg 25%氨基甲酸乙酯溶液以腹腔注射对大鼠进行麻醉，断头处死大鼠，取前脑，沿矢状缝切开，左侧大脑留作分子生物学实验用，－80℃保存备用；右侧脑组织用生理盐水制成10%的组织匀浆，4 000r／min离心，取上清液，用试剂盒检测脑组织中SOD、MDA、GSH－Px含量。

1.5 大鼠脑组织KATPmRNA表达的检测 取100mg左右脑组织按步骤抽提RNA，测RNA浓度后取3μg行逆转录反应得到cDNA，引物按Genebank所提供的基因序列设计，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。SUR2A／B前引物：5′－gCAAgAgCgTggAAgAgAC－3′， 后 引 物 5′－TgCCCCAT－gAgAAgTATCC－3′，产物为501bp。内参 GAPDH 前引物5′－TCCTgCACCACCAACTgCTTAg－3′，后引物5′－gATgACCTT－gCCCACAgCCTTg－3′，产物为208bp。SUR2A／B的扩增条件：95℃2min，然后 94℃30s，54 ℃ 30s，72 ℃ 40s（30个循环），72℃延伸10min。内参GAPDH的扩增条件：94℃2 min，然后94℃ 45s，59℃，45s，72 ℃ 45s（30个循环），72℃延伸10min。产物进行电泳和拍照。用天能凝胶成像系统观察结果并扫描保存，进行PCR条带灰度扫描，以GAPDH作为内参，作半定量分析。SUR2A／B mRNA相对量＝SUR2A／B条带灰度值／GAPDH条带灰度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑组织SOD、MDA、GSH－Px含量比较 长期大量饮酒大鼠脑组织MDA含量较对照组显著升高，SOD和GSH－Px含量则显著降低（P＜0.01）。在饮酒同时加服2%牛磺酸，可使大鼠脑组织中MDA含量降低（P＜0.05），升高SOD（P＜0.05）及GSH－Px活性（P＜0.01），但单独应用0.05%维生素C则无显著改变。0.05%维生素C与2%牛磺酸合用，增强牛磺酸的抗氧化作用（P＜0.01）。详见表1。

表1 各组大鼠脑组织SOD、MDA、GSH－Px含量比较（x±s）

2.2 各组大鼠脑组织中SUR2A／B mRNA表达 长期大量饮酒大鼠脑组织中SUR2A／B mRNA表达量较对照组显著减少（P＜0.01）；与长期饮酒的大鼠相比，饮酒时加服2%牛磺酸或0.05%维生素C和2%牛磺酸合用，可使大鼠脑组织中SUR2A／B mRNA表达量显著增加（P＜0.01）。详见图1。

图1 维生素C合用牛磺酸对长期饮酒大鼠脑组织中SUR2A／B mRNA表达的影响

3 讨 论

长期大量饮酒脑内大量自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成和堆积，增强氧化应激反应，引起的自由基损害，是造成神经系统受损的主要原因［7］。本实验观察到长期饮酒使大鼠脑组织MDA含量升高，而SOD和GSH－Px含量降低，表明在长期大量酒精的慢性刺激下，大鼠脑细胞内的脂质过氧化反应增强，而细胞内的抗氧化反应降低。牛磺酸与维生素C合用增加SOD与GSH－Px含量，降低MDA水平，说明抗氧化剂能通过抑制氧化应激反应而减轻酒精对大鼠脑的损伤作用。

KATP通道是一类由磺酰脲类受体（Sulfonylurea receptor，SUR）亚家族亚基与内向整流钾通道（inwardly rectified potassium channel，Kir）亚基组成的异源性多聚体，由4个内向整流钾通道（Kir6.1或Kir6.2）亚单位和4个调节性磺脲类受体（SUR1，SUR2A 或 SUR2B）组成［8］。研究证明［9］，KATP通道开放能使细胞膜超极化，降低神经元兴奋性，从而防止神经细胞的兴奋毒作用氧自由基级联反应所引起的脂质过氧化损伤。本实验发现，长期大量饮酒使大鼠脑组织中SUR2A／B mRNA表达量显著减少，这表明酒精慢性摄入抑制了KATP通道的表达量。实验中使用牛磺酸以及合用维生素C能使长期饮酒大鼠脑组织SUR2A／B mRNA表达量显著增加，表明其抗氧化作用可能有KATP通道的作用参与。

综上所述，牛磺酸及其合用维生素C对长期饮酒大鼠脑损伤有积极的保护作用，该作用与其抗氧化及上调KATP通道mRNA表达有关。

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