RNA干扰下调PPP2R5C对T-ALL TCR Vβ亚家族分布和克隆增殖的影响

徐 艳， 陈 宇， 周玲玲， 刘思初， 杨力建，陈少华， 罗更新， 李扬秋，

(暨南大学1.再生医学教育部重点实验室;2.医学院血液病研究所，广东 广州 510632;3.第一附属医院 血液科，广东 广州 510630)

T细胞-急性淋巴细胞白血病 (T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)是以T细胞克隆性增生、积聚及组织浸润为特征的血液系统恶性疾病，其恶性程度高、耐药和易复发、治疗效果差且预后不良［1］.因此，研究T细胞肿瘤的一个重要目标就是寻找更有效和特异的治疗方案.近年已有报道了一些针对T细胞靶基因的单抗和干扰性小分子RNA(small interfering RNA，siRNA)的实验研究，让逐渐发展起来的靶向治疗为T细胞肿瘤的治疗带来了新的希望［2］.本研究小组前期研究发现一些与T细胞增殖相关的基因如BCL11B和PPP2R5C等在TALL细胞异常高表达，而在正常T细胞中表达水平很低［3-4］.并进一步证明了靶向特异性小干扰RNA可下调BCL11B和PPP2R5C基因表达，抑制T细胞白血病细胞株Molt-4和Jurkat细胞的增殖和诱导细胞凋亡［5］.而在RNA干扰处理的过程，是否对正常T细胞产生影响，值得进一步研究.因此，本研究利用RT-PCR和基因扫描法分析了经过PPP2R5C siRNA处理的T-ALL病人外周血T细胞的24个TCR Vβ亚家族的谱系分布和克隆性增殖情况，初步了解RNA干扰后，T-ALL患者T细胞的改变特点.

1 材料与方法

1.1 材料

样本收集经细胞形态学、组织化学和免疫学确诊的初发未治T-ALL编号为C1和C2病人2例肝素抗凝外周血.在无菌条件下，按常规方法分离外周血单个核细胞(PBMC)，部分用于进行RNA干扰等实验，部分直接用于提RNA.

1.2 方法

(1)细胞转染 利用前期已经证明具有特异抑制PPP2R5C基因的siRNA(PPP2R5C-siRNA799，专利号:ZL201110340411.1分别处理2例T-ALL样本PBMC，除了PPP2R5C-siRNA799实验组，同时设无关干扰序列RNA的阴性对照组(Scrambled non-silencing siRNA control，SC)和未予任何处理的与实验同步培养的空白对照组(Non-treated cells，NC).每组单次收集2.5×106/个处于对数生长期的TALL病人细胞，1 100 r/min离心10 min，完全去除上清;用100 μL预热至室温的NucleofectorTMSolution和Supplement混合液二者比例9∶2，即配即用;悬浮细胞;各组分别加入1 μL siRNA799或者SC，核转染专用的移液管混匀后加入核转杯，启动核酸转染仪特异性程序，根据指南，各种细胞的转染时所选择的程序原代T-ALL:U-014，转染完成后立刻用核转染试剂盒里配套的移液管将转染后的细胞液，接种于含体积百分数5%CO2的培养箱37℃预热过的，含体积百分数10%新生牛血清、质量浓度均为0.06 mg/mL青霉素和链霉素的RPMI1640培养基的培养瓶中，空白对照组则直接接种于同样预处理过的培养基中.每组均增设4个平行杯，总数为1.0×107/个原代T-ALL细胞，转染后接种于同一培养瓶中，终体积为20 mL，以保证各项检测指标所需的细胞数［6］.

(2)RNA提取和cDNA合成 分别收集转染后48 h的各组细胞约2.0×106/个，离心去上清后加入0.8 mL TRIZOL试剂充分混匀按常规方法RNAzol试剂盒提取所收集的外周血单个核细胞的RNA，并应用随机引物和反转录酶试剂盒(Power-Scrip tTMReverse)反转录合成cDNA第1链，然后以RT-PCR检测β2微球蛋白基因确定合成cDNA的质量.

(3)PPP2R5C的相对定量分析 采用相对定量法分析T-ALL细胞中PPP2R5C基因相对mRNA的表达水平，以β2M为内参照，利用 Ct值，计算 TALL细胞中PPP2R5C基因相对mRNA表达量，其计算公式为［7］:相对 mRNA 表达量 =2-△Ct×100%，其中，△Ct=Ct(PPP2R5C)-Ct(β2M).

(4)反转录-多聚酶链反应(RT-PCR) 根据Vβ24个亚家族基因设计相应的24个Vβ特异性上游引物，并在Cβ区设一Cβ下游引物，引物均由德国柏林TIB公司合成［8］.每一标本分别以 Vβ1-24/Cβ24对引物进行24次PCR检测.PCR操作按文献［9］.总反应体积为 25 μL，其中含 1 μL cDNA，浓度为 0.1 mmol/L dNTP(包括 dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，任一 Vβ 引物和 Cβ 引物浓度为 0.5 μmol/L，1.25 U 聚合酶(Promega)，反应在 PCR 缓冲:浓度分别为 1 mmol/L Tris-HCl，pH=8.3，5 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2及质量浓度 0.01 g/L明胶中进行，共进行40个循环，94℃ 1 min而 首次为3 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min且 末次为10 min，结束后保存于4℃中.各反应均设阳性和阴性对照，并设正常对照.PCR产物于质量浓度为25 g/L琼脂糖凝胶中电泳分析结果.

(5)T细胞克隆性分析

①标记PCR产物 将首次TCR Vβ PCR产物标上荧光素，10 μL的反应体系含2.5 μL 的未标记的 PCR 产物、浓度分别为 0.1 μmol/L Cβ-Fam 引物［10］、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、1.0 U Taq聚合酶和1×PCR缓冲液.PCR共进行40个循环，退火温度为66℃，其余条件同上.

②基因扫描分析(CDR3长度分析) 经荧光素Fam标记的PCR产物按比例混合去离子甲酰胺与标准品 (GeneScanTM-500-LIZTM，ABI，USA)，利用3100 DNA序列分析仪进行基因扫描分析.电泳过程中所收集的不同位置和高度的峰表示产物的大小和含量;峰的形态提示产物的均一性即克隆性，当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致时，电泳时，其迁移率完全相同，故在同一时间点通过扫描探头，所显示的结果为一单峰图象，提示为PCR产物来自于CDR3长度完全相同的T细胞，即单克隆的细胞;而一主峰和少数小峰图象提示产物主要来自同一克隆即为寡克隆性，而多峰图象提示多克隆性;图像介于多克隆与寡克隆图像之间，呈一主峰明显高于其他峰的图像并有向寡克隆发展趋势，提示为寡克隆增殖趋势［11］.

2 结果

2.1 转染后48 h T-ALL细胞PPP2R5C基因mRNA表达水平

T-ALL病人外周血单个核细胞转染PPP2R5C-siRNA2后48 h，与SC组、NC组相比，转染组2例T-ALL细胞的PPP2R5C的mRNA表达水平均明显下调(图1)，RNA干扰抑制PPP2R5C后，可明显抑制T-ALL细胞增殖并在一定程度上诱导细胞凋亡.

图1 转染48 h两组T-ALL细胞PPP2R5C基因mRNA水平变化Fig.1 The relative expression level of PPP2R5C in mRNA from 2 cases with T-ALL after siRNA treatment at 48 h

2.2 TCR Vβ亚家族T细胞的表达和克隆性增殖情况

2例初发T-ALL样本外周血中可以检测到的NC组Vβ亚家族T细胞及其克隆(图2)，病例1可检测到 24个 Vβ亚家族中的 17个 Vβ亚家族(70.8%)，而病例2则可检测到10个 Vβ亚家族(41.7%)，多数Vβ亚家族T细胞呈多克隆性，病例1中Vβ9和Vβ17亚家族T细胞为寡克隆性，而病例2中，Vβ14和 Vβ16亚家族呈寡克隆性.T-ALL病人外周血单个核细胞经过PPP2R5C-siRNA处理后，TCR Vβ亚家族表达率降低，病例1仅检测到4个Vβ亚家族，病例2则仅检测到3个Vβ亚家族，分别为 Vβ2，Vβ3，Vβ16 和 Vβ17.其中，有 3 个 Vβ家族的克隆性模式发生改变，病例1中，Vβ3由多克隆转变为寡克隆，而Vβ17则由寡克隆转为多克隆，而病例2中，Vβ16也由寡克隆转变为多克隆.但是，无关序列对照组(SC)中，病例1与2分别仅检测到4个和5个Vβ亚家族，两例病人中均可检测到与未处理样本相同的Vβ13亚家族的多克隆性T细胞.此外，病例1中，SC组的Vβ16亚家族T细胞的克隆性也发生改变，呈寡克隆性，与初发时样本的多克隆性不同(图2).

图2 PPP2R5C-siRNA处理前后2例T-ALL(C1和C2)病人T细胞的Vβ亚家族的分布和克隆性分析Fig.2 The distribution and clonality of Vβ subfamilies in T cells from 2 cases with T-ALL(C1 and C2)before and post PPP2R5C-siRNA treatment

3 讨论

蛋白磷酸酶2A(proten phosphatase 2A，PP2A)作为一种主要的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，在磷酸化信号平衡中起重要作用，调节并影响着许多关键调节蛋白的磷酸化状态，并与一些信号转导通路的调节、细胞增殖和分化、细胞恶性转化、细胞凋亡诱导、细胞周期调节、基因表达控制、DNA复制/转录和胚胎发育等相关，而PPP2R5C作为蛋白磷酸酶2A的一个重要的调节亚单位，对其功能的发挥具有重要的作用.有研究表明PPP2R5C可能是一种抑癌基因，PPP2R5C异常的表达或表达模式的改变都可能影响正常细胞的增殖甚至导致细胞的恶性转化［12］，提示PPP2R5C的异常高表达可能与T细胞肿瘤的形成有关，而T细胞肿瘤是一种恶性度高、治疗效果差且易复发的血液肿瘤.除了常规治疗方法外，目前尚未有较好的靶向治疗方法，最主要的原因是难以找到一个具有普遍性的特异性靶向治疗靶点.在肿瘤性T细胞中异常表达的分子可以作为研制抑制T细胞肿瘤靶向分子药物，已有报道抗Notch1单抗和小干RNA抑制在T细胞白血病中异常表达或突变的Notch1［13］.本研究小组的前期研究首先在1例TALL发现涉及 PPP2R5C基因重排，并导致PPP2R5C基因异常表达［14］，随后还发现PPP2R5C在多种白血病中均呈高表达状态［4］，提示有可能成为白血病靶向治疗的一个靶点.因此，通过研究RNA干扰技术筛选出2条高效抑制肿瘤T细胞PPP2R5C表 达 的 PPP2R5C-siRNA，分 别 为PPP2R5C-siRNA799和 PPP2R5C-siRNA991，并均已获得国家发明专利授权.

本研究进一步利用PPP2R5C-siRNA799处理初发T-ALL病人外周血单个核细胞，初步研究结果显示，PPP2R5C-siRNA对原代T-ALL细胞具有一定的抑制作用，但对细胞的整体生物学效应影响还有待进一步深入研究.本研究小组前期研究已经提示，利用PPP2R5C-siRNA可以特异地抑制高表达PPP2R5C 的白血病 T 细胞［2，6］，而正常 T 细胞由于低表达PPP2R5C，受抑制作用可能相对较弱，但由于RNA干扰可能在一定程度上抑制正常细胞的功能，本研究小组曾报道靶向抑制白血病T细胞的BCL11B-siRNA对造血干祖细胞(CD34+细胞)的增殖和分化无明显的影响［15］.本研究的主要目的是进一步分析PPP2R5C-siRNA对病人T细胞谱系的抑制作用，在初发T-ALL病人外周血单个核细胞中，绝大部分T细胞为来自克隆性增殖的肿瘤细胞，而仍有小部分正常T细胞，可由不同TCR亚家族T细胞组成，在分析2例初发T-ALL病人外周血的TCR Vβ亚家族表达情况时可见，病人外周血中的确存在多个家族多克隆性的正常T细胞亚家族，这和我们既往报道的结果相似［16］.由于本研究的主要目的是分析PPP2R5C-siRNA对TCR Vβ亚家族表达和克隆性的影响，因此，本研究并没有特别鉴定T-ALL所属的肿瘤性T细胞克隆，尽管可以检测到2例TALL中均存在寡克隆性增殖的T细胞，但未能明确哪一个为肿瘤性T-ALL，明确鉴定肿瘤性T-ALL克隆，可通过流式细胞术或精细定位的寡核苷酸阵列比较基因组杂交(FT-aCGH)技术加以鉴定［17］.本研究已经明确病例2的T-ALL克隆为TCRγδ+T细胞(结果未报道)，因此，所分析的TCR Vβ亚家族T细胞代表正常T细胞的增殖情况.经过siRNA干扰处理48 h后，2例样本中仅能检测到3或4个Vβ亚家族的T细胞，提示PPP2R5C-siRNA干扰处理对Vβ亚家族的T细胞的增殖具有总体上的抑制作用，但发现在无关序列对照组(SC)检测也仅能检测到略为增多的TCR Vβ亚家族.因此，需要同时考虑的因素是小干扰RNA的非特异性抑制作用，还需要增加样本数，健康人外周血T细胞的RNA干扰实验研究，采用其他的转染方式等等，进一步排除各种因素和明确PPP2R5C-siRNA对各TCR亚家族T细胞的影响.此外，由于PPP2R5C-siRNA的特异性抑制主要针对高表达PPP2R5C细胞，而对于白血病T细胞所表达的TCR谱系没有直接的影响.因此，本研究更主要的是观察通用性的抑制影响，至于哪些正常TCR家族的T细胞受累与否可能与其自身表达水平有关联.

总之，本研究中分析RNA干扰下调白血病T细胞PPP2R5C基因表达后，T-ALL患者外周血TCR Vβ各亚家族T细胞的分布特点和克隆性改变的情况，初步认为PPP2R5C-siRNA在抑制白血病T细胞的同时，可能对某些TCR亚家族T细胞有一定的抑制作用，也可能会对T细胞的增殖能力和功能造成短时间的影响，提示在未来设计基因靶向治疗T细胞白血病时，同时需要考虑T细胞免疫功能的改善问题.但仍然需要更多的实验数据来发现其规律性和提供更全面的资料.

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