耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞株耐药关系与形态变化分析

王建军,周 芳,卢 红

(河南大学淮河医院肿瘤科,河南开封475001)

耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞株耐药关系与形态变化分析

王建军,周 芳,卢 红

(河南大学淮河医院肿瘤科,河南开封475001)

目的 探索原代细胞株与耐药细胞株在光学显微镜与电子显微镜下的形态学变化。方法 用逐渐递增药物浓度冲击诱导法,逐渐建立耐药细胞株;MTT法测定细胞株的耐药指数;用光学显微镜与电子显微镜观察耐药株与云带细胞株形态学变化。结果 耐药细胞株较原代细胞株的细胞体积增大,细胞分裂像减少,伪足突起减少;电子显微镜下伪足绒毛减少,细胞器有浓聚,高尔基体数量减少,细胞核染色体有核膜下浓聚。结论 耐药细胞株细胞状态处于受抑制状态,生命能力下降。

骨肉瘤;耐药细胞株;形态学

骨肉瘤是青少年最常见的骨恶性肿瘤,其临床特点在于具有很强的局部浸润能力和快速发生的远处肺转移能力。虽然手术和化疗的应用使骨肉瘤的预后有很大的提高,复发是影响预后的重要因素。近年来研究认为肿瘤耐药是引起复发和转移因素之一[1-3]。探索肿瘤耐药的原因,为克服耐药寻找方法,进一步提高患者的预后。MTX是治疗骨肉瘤的重要药物,被用在对骨肉瘤患者的新辅助化疗和辅助化疗中,是骨肉瘤化疗的主要药物[4]。我们通过诱导建立耐MTX的骨肉瘤体外模型,为进一步研究骨肉瘤耐药机制提供研究工具。在实验过程中,通过观察耐药细胞与原代细胞株形态学上差别。发现耐药细胞株特征表现。

1 材料和方法

1.1 细胞株与药物

Saos-2细胞株(ATCC,Manassas,VA),购自中国科学院上海细胞生物所。methotrexate(MTX) MTX,上海华联制药,药物用生理盐水或50 g/L葡萄糖液稀释成相应浓度,分装后-20℃保存。

1.2 实验方法

1.2.1 Saos-2原代细胞的培养 Saos-2细胞用RPMI-1640培养基(含体积分数10%胎牛血清、链霉素和青霉素各100μ/mL)于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。待细胞增殖至铺满培养皿底60～70%时传代。

1.2.2 Saos-2细胞的药物诱导 采用递增药物浓度冲击诱导法,待细胞增殖至铺满培养皿底60～70%对数期状态时,加入起始浓度为0.05μg/m L的MTX,作用24 h后用37℃的1×PBS液洗2次,待细胞增殖至正常状态后,重复上述药物冲击方法,每一种药物浓度冲击3次。MTX药物递增浓度为0.05、0.5、1、2μg/m L。耐药诱导历时6个月,不同药物浓度点细胞株分别命名为Saos-2/MTX0.05、Saos-2/MTX0.5、Saos-2/MTX1、Saos-2/MTX2。

1.2.3 药敏试验 采用MTT法检测Saos-2、Saos-2/ MTX1、Saos-2/MTX2细胞株对MTX、IFO、DDP、ADM的敏感性。取对数生长期的Saos-2、Saos-2/MTX1、Saos-2/MTX2细胞,用RPMI-1640培养液制备单细胞悬液,分别接种到96孔板(200μL/孔,细胞数约1×104/孔)培养24 h,参照临床药物MTX血浆峰浓度(peak plasma concentration,PPC),配制成7个药物浓度梯度实验孔,药物浓度分别为:1 000 ppc、100 ppc、10 ppc、1 ppc、0.1 ppc、0.01 ppc、0.001 ppc,并每一浓度孔设3个复空,培养24 h后,每孔加入5%MTT 20μL培养4 h,弃上清液,加入二甲亚砜150μL/孔,室温充分震荡10 min。用Wellscan MK3型酶标仪测每孔吸光度值,波长为490 nm,并分别设无细胞培养液及接种细胞但不加药物的细胞株做空白对照组。细胞抑制率=(1-耐药组平均吸光度值/对照组平均吸光度值×100%),确定半数抑制浓度(IC50)。计算耐药指数(resistance index, RI)=IC50(Saos-2/MTX1)/IC50(Saos-2)和IC50(Saos-2/MTX2)/IC50(Saos-2)。

1.2.4 细胞光学显微镜下形态学观察 在倒置显微镜下观察Saos-2,Saos-2/MTX1、Saos-2/MTX2细胞株光镜下形态。

1.2.5 细胞电子显微镜下形态学观察 另取对数期生长期的Saos-2、Saos-2/MTX1、Saos-2/MTX2细胞株,先用体积分数3%戊二醛预固定,体积分数1%四氧化锇再固定,丙酮逐级脱水,Epon812包埋,醋酸铀及枸橼酸铅双重染色,透射电镜观察细胞核与细胞器的变化。

2 结果

2.1 Saos-2、Saos-2/MTX1、Saos-2/MTX2细胞株的药物敏感性

MTT检测结果表明:Saos-2、Saos-2/MTX1、 Saos-2/MTX2细胞株对MTX的IC50分别为(25.78 ±0.29)μg/m L、(125.56±0.24)μg/m L和(328.24 ±0.29)μg/m L,Saos-2/MTX1的RI是Saos-2的4.87倍,低度耐药;Saos-2/MTX2细胞的RI是Saos-2的12.73倍,中度耐药;并且对IFO、ADM存在低度耐药;而对DDP无明显耐药性。

2.2 光镜下细胞形态变化

倒置显微镜下观察到Saos-2细胞贴壁生长,体积中等,大小均匀,细胞有明显伪足生长,胞浆较少,胞浆耐细胞颗粒明显,细胞核较大,核仁清晰,可见明显细胞分裂象,有明显多核现象,可见细胞内染色体团块现象,凋亡小圆细胞比例较少。(见图1)。Saos-2/MTX 1细胞株细胞体积稍增大,有伪足突起现象,胞浆内细胞颗粒明显增多,细胞核较原代增大明显,细胞核分裂象叫原代少见,可常见细胞核内染色体团聚现象,凋亡小圆细胞比例较原代细胞增多常见(见图2)。Saos-2/MTX2光镜下观察细胞贴壁生长,细胞体积较Saos-2明显增大,细胞椭圆形、多角形,伪足现象较原代较少,胞浆较原代致密,胞浆着色加深,细胞器密集。细胞核体积较原代减小,多核、核分裂现象减少,核膜不清晰,核内染色体聚集现象不明显。小圆凋亡细胞明显增多见(见图3)。

图1 原代Saos-2细胞株光镜下观察

图2 耐药Saos-2/MTX1细胞株光静下观察

图3 Saos-2/MTX2细胞株光镜下观察

2.3 电子显微镜下细胞形态变化

电子显微镜下观察到Saos-2原代细胞株,细胞膜完整,伪足、细胞绒毛丰富,胞浆内胞浆丰富,可见细胞内脂肪空泡,线粒体大小均匀,形态完整,可见明显内脊凸起;高尔基体数量多,有多层折叠。核膜完整,未见染色体浓聚现象,核仁明显(见图4);Saos-2/ MTX 1细胞株细胞膜完整,细胞绒毛凸起较原代减少,细胞胞浆丰富,线粒体数量在一个细胞内有增多,线粒体较原代体积减小,形态完整;高尔基体数量可见,较原代减少。核膜完整,未见染色体浓聚现象,核仁明显(见图4);Saos-2/MTX2电镜下观察,细胞多形性,包膜完整,细胞绒毛进一步减少,细胞浆较少,线粒体数量下降,胞浆内染色体浓聚颗粒明显,高尔基体少见。核膜完整,染色体未见浓聚核膜现象,核仁不明显(见图6)。

图4 原代Saos-2细胞株电子显微镜下观察(×5800倍)

图5 原代Saos-2/MTX1细胞株电子显微镜下观察(×5800倍)

图6 原代Saos-2/MTX2细胞株电子显微镜下观察(×5800倍)

3 讨论

化学治疗是骨肉瘤综合治疗的重要组成部分,化疗方案加入治疗后,治疗效果有明显提高,改善了患者预后,也提高了保肢率,提高了患者生存质量[5]。本实验初步观察耐药细胞株在耐药产生后,出现的细胞形态改变,耐药细胞株两株表现,随着细胞耐药能力增强,细胞再生能力,细胞代谢能力下降,细胞凋亡数量增多,光镜下多核现象增多;电镜下特点也支持这个观点,细胞器数量增多,高尔基体叠层减少,说明细胞浆内容数量减少。说明细胞分裂时间周期长,分裂细胞数目整体下降。所以说整体来说细胞耐药还是对新环境的不适应,细胞整体能力下降,但是随着细胞自身适应能力调整,有可能恢复原来的增值能力。

[1]Fuchs B,Pritchard D J.Etiology of osteosarcoma[J].Clin Orthop Rel Res,2002(397):40-52.

[2]Marina N,Gebhardt M,Teot L,Gorlick R.Biology and therapeutic advances Of pediatri costeosarcoma[J].Oncologist,2004,9(4):422-441.

[3]Ferrari S,Palmerini E.Adjuvant and neoadjuvant combination chemotherapy for Osteogenic sarcoma[J].Curr Opin Oncol,2007,19(8):341-346.

[4]Chou A J,Gorlick R.Chemotherapy resistance in osteosarcoma:current Challenges and future directions[J]. Expert Rev Anticancer Ther,2006,6(2):1 075-1 085.

[5]Jaffe N.Recent advances in the chemotherapy of metastatic osteogenic sarcoma[J].Cance 1972,30(2):1 627-1 631.

[责任编辑 李武营]

Analysis of methotrexate in osteosarcoma cell line resistance and morphological changes of resistance

WANG Jianjun，ZHOU Fang，LU Hong
（Department of Oncology，Huaihe Hospital of Henan University，Kaifeng，Henan 475001，China）

Objective To explore the primary cells and multidrug resistance cell morphological changes in the optical microscope and electron microscope.Methods Using gradually increasing drug concentration shock induced method.Gradually establish a multidrug resistance cell line resistant index determination；MTT cell line；observation of resistant strains and cloud band cell morphological changes by optical microscopy and electron microscopy.Results The drug resistant cell line than the primary cultured cell lines increased cell volume，cell division like pseudopodium projection reduction；electron microscope pseudopodia fluff reducing，organelles are concentrated，the Golgi complex decreased，the chromosomes are condensed concentration.Conclusion Drug resistant cell line cell state is restrained，life ability to drop.

Osteosarcoma；Drug resistant cell lines；Morphology

R730.53

A

1672-7606(2014)03-0158-03

2014-05-21

王建军(1967-)男,河南开封人,副主任医师,从事临床肿瘤的诊治与研究工作。