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马里兰烟SSR分子标记分析

2014-07-02陈云陈磊乐超银

湖北农业科学 2014年6期
关键词:烟草

陈云 陈磊 乐超银

摘要:采用SSR分子标记分析了五峰7个主栽烟草(Nicotiana tabacum L.)品种。结果表明,6对引物共检测到22个多态位点,7个品种的遗传相似系数为0.347 8~0.913 0。

关键词:SSR分子标记;烟草(Nicotiana tabacum L.);马里兰烟

中图分类号:S572 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2014)06-1440-02

Analysis of SSR Molecular Marker in Maryland Tobacco

CHEN Yun,CHEN Lei,YUE Chao-yin

(Three Gorges University Biotechnology Research Center,Yichang 443002,Hubei,China)

Abstract: 7 tobacco cultivars were analyzed by SSR molecular marker. The results showed that the 6 primer pairs amplified a total of 22 polymorphic alleles. The genetic similarity (GS) of 7 tobacco cultivars was ranged from 0.347 8~0.913 0.

Key words: SSR molecular marker; Nicotiana tabacum L.; Maryland tobacco

烟草(Nicotiana tabacum L.)是世界性的经济作物,也是湖北省宜昌市五峰县的重要经济作物之一。烟草育种面临着遗传背景狭窄等问题,种质资源多样性是选育优良烟草品种的基础,传统的种质资源鉴定方法有形态鉴定、蛋白质及同工酶鉴定等[1],但这些方法操作复杂,常用的分子标记技术有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR等[2-4],其中SSR分子标记具有多态性高、共显性遗传、多等位基因、信息量高等优点[5]。本研究利用SSR分子标记技术,鉴定了湖北省宜昌市五峰县的6份马里兰烟及1份烤烟的种质资源,为充分利用马里兰烟种质资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以湖北省宜昌市五峰县的7个烟草品种为材料,包括五峰1号、五峰2号、Md01、Md02、Md30、Md40和NC89,其中NC89为烤烟。烟草种子由湖北省宜昌市烟草局提供。

1.2 DNA的提取

供试材料温室育苗,当幼苗长至5~6片叶时,取0.1 g叶片,用无菌水洗去叶表面的虫子,然后用液氮充分研磨。采用改良的CTAB法提取烟草的基因组DNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检测后,于-20 ℃保存备用。

1.3 SSR分析

试验所用SSR引物序列参考文献[3-5]中的引物。PCR扩增总体积20 μL,包括10×PCR缓冲液2 μL, dNTPs 0.4 μL,Taq 酶 0.2 μL,上、下游引物各0.6 μL,基因组DNA 2.0 μL,ddH2O补至20 μL。PCR 反应程序为:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,52 ℃退火 45 s,72 ℃延伸50 s,33个循环;72 ℃延伸10 min,最后4 ℃保存。PCR扩增产物先以1%琼脂糖凝胶检测扩增产物有无,再以6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,以1×TBE作缓冲液180 V恒压进行电泳,电泳时间75 min后进行银染,并拍照记录。

1.4 数据分析

PCR扩增产物按同一位置上条带在各个材料中的有清晰图谱且可重复出现的记为“1”,同一位置上无条带的记为“0”。应用软件NTsys Version 2.10,以共有DNA片段比例(软件中参数为DICE)作为指标,计算供试材料间的相似系数。采用非加权类平均法UPGMA(Unweighted Pair-Group Average)进行聚类分析。

2 结果与分析

通过对30对SSR引物进行筛选,选出6对反应稳定、多态性较好的引物,6对SSR引物共检测到22个多态位点(图1),每对引物3~5个,其中引物M1检测到6个多态位点,PT20372检测到4个多态位点,使用这种鉴别能力高的引物能将所有供试品种分开。五峰1号和Md02遗传相似系数最大为0.913 0,五峰2号和NC89的遗传相似系数最小为0.347 8,不同品种的马里兰烟遗传相似系数为0.478 3~0.913 0(表1)。

聚类分析(图2)显示五峰1号和Md02为一组,五峰2号和Md01为一组,Md30和Md40为一组,NC89为区别于马里兰烟品种的另一类群。

3 小结与讨论

SSR分子标记应用于烟草种质鉴定的起步较晚,Binder等[6]首次公开报道了烟草SSR分子标记的研究工作,并建立了第一张微卫星连锁图。本研究采用SSR分子标记技术分析了7个烟草品种。结果发现6对引物具有较好多态性,能将这7个品种完全区分开,表明将其他品种多态性好的SSR引物应用在构建马里兰烟遗传图谱上是可行的。聚类分析结果将马里兰烟和烤烟划分为两大类群,这一点与实际的种质资源相符,也证明了SSR分子标记用于烟草类型划分的可行性。

参考文献:

[1] LIANG M, LIU Y, ZHOU X, et al. Studies on protein fingerprints for identification of nicotiana varieties[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences,2000(2):16.

[2] 罗 冉,吴委林,张 旸,等.SSR 分子标记在作物遗传育种中的应用[J]. 基因组学与应用生物学,2010,29(1):137-143.

[3] 徐 军,刘艳华,任 民,等.普通烟草种质资源的SSR标记与指纹图谱分析[J].中国烟草科学,2011,4(32):2.

[4] 叶兰钦,辛明明,杜金昆,等.SSR标记应用于烟草品种遗传多样性研究[J].中国农学通报,2009,25(1):56-62.

[5] 王凤龙,时 焦,钱玉梅,等.烟草种质资源对黄瓜花叶病毒抗性鉴定研究[J].中国烟草科学,2000(3):1-4.

[6] BINDLER G,HOEVEN V R,GUNDUZ I, et al. A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theo Appl Genet,2007,114(2):341-349.

摘要:采用SSR分子标记分析了五峰7个主栽烟草(Nicotiana tabacum L.)品种。结果表明,6对引物共检测到22个多态位点,7个品种的遗传相似系数为0.347 8~0.913 0。

关键词:SSR分子标记;烟草(Nicotiana tabacum L.);马里兰烟

中图分类号:S572 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2014)06-1440-02

Analysis of SSR Molecular Marker in Maryland Tobacco

CHEN Yun,CHEN Lei,YUE Chao-yin

(Three Gorges University Biotechnology Research Center,Yichang 443002,Hubei,China)

Abstract: 7 tobacco cultivars were analyzed by SSR molecular marker. The results showed that the 6 primer pairs amplified a total of 22 polymorphic alleles. The genetic similarity (GS) of 7 tobacco cultivars was ranged from 0.347 8~0.913 0.

Key words: SSR molecular marker; Nicotiana tabacum L.; Maryland tobacco

烟草(Nicotiana tabacum L.)是世界性的经济作物,也是湖北省宜昌市五峰县的重要经济作物之一。烟草育种面临着遗传背景狭窄等问题,种质资源多样性是选育优良烟草品种的基础,传统的种质资源鉴定方法有形态鉴定、蛋白质及同工酶鉴定等[1],但这些方法操作复杂,常用的分子标记技术有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR等[2-4],其中SSR分子标记具有多态性高、共显性遗传、多等位基因、信息量高等优点[5]。本研究利用SSR分子标记技术,鉴定了湖北省宜昌市五峰县的6份马里兰烟及1份烤烟的种质资源,为充分利用马里兰烟种质资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以湖北省宜昌市五峰县的7个烟草品种为材料,包括五峰1号、五峰2号、Md01、Md02、Md30、Md40和NC89,其中NC89为烤烟。烟草种子由湖北省宜昌市烟草局提供。

1.2 DNA的提取

供试材料温室育苗,当幼苗长至5~6片叶时,取0.1 g叶片,用无菌水洗去叶表面的虫子,然后用液氮充分研磨。采用改良的CTAB法提取烟草的基因组DNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检测后,于-20 ℃保存备用。

1.3 SSR分析

试验所用SSR引物序列参考文献[3-5]中的引物。PCR扩增总体积20 μL,包括10×PCR缓冲液2 μL, dNTPs 0.4 μL,Taq 酶 0.2 μL,上、下游引物各0.6 μL,基因组DNA 2.0 μL,ddH2O补至20 μL。PCR 反应程序为:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,52 ℃退火 45 s,72 ℃延伸50 s,33个循环;72 ℃延伸10 min,最后4 ℃保存。PCR扩增产物先以1%琼脂糖凝胶检测扩增产物有无,再以6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,以1×TBE作缓冲液180 V恒压进行电泳,电泳时间75 min后进行银染,并拍照记录。

1.4 数据分析

PCR扩增产物按同一位置上条带在各个材料中的有清晰图谱且可重复出现的记为“1”,同一位置上无条带的记为“0”。应用软件NTsys Version 2.10,以共有DNA片段比例(软件中参数为DICE)作为指标,计算供试材料间的相似系数。采用非加权类平均法UPGMA(Unweighted Pair-Group Average)进行聚类分析。

2 结果与分析

通过对30对SSR引物进行筛选,选出6对反应稳定、多态性较好的引物,6对SSR引物共检测到22个多态位点(图1),每对引物3~5个,其中引物M1检测到6个多态位点,PT20372检测到4个多态位点,使用这种鉴别能力高的引物能将所有供试品种分开。五峰1号和Md02遗传相似系数最大为0.913 0,五峰2号和NC89的遗传相似系数最小为0.347 8,不同品种的马里兰烟遗传相似系数为0.478 3~0.913 0(表1)。

聚类分析(图2)显示五峰1号和Md02为一组,五峰2号和Md01为一组,Md30和Md40为一组,NC89为区别于马里兰烟品种的另一类群。

3 小结与讨论

SSR分子标记应用于烟草种质鉴定的起步较晚,Binder等[6]首次公开报道了烟草SSR分子标记的研究工作,并建立了第一张微卫星连锁图。本研究采用SSR分子标记技术分析了7个烟草品种。结果发现6对引物具有较好多态性,能将这7个品种完全区分开,表明将其他品种多态性好的SSR引物应用在构建马里兰烟遗传图谱上是可行的。聚类分析结果将马里兰烟和烤烟划分为两大类群,这一点与实际的种质资源相符,也证明了SSR分子标记用于烟草类型划分的可行性。

参考文献:

[1] LIANG M, LIU Y, ZHOU X, et al. Studies on protein fingerprints for identification of nicotiana varieties[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences,2000(2):16.

[2] 罗 冉,吴委林,张 旸,等.SSR 分子标记在作物遗传育种中的应用[J]. 基因组学与应用生物学,2010,29(1):137-143.

[3] 徐 军,刘艳华,任 民,等.普通烟草种质资源的SSR标记与指纹图谱分析[J].中国烟草科学,2011,4(32):2.

[4] 叶兰钦,辛明明,杜金昆,等.SSR标记应用于烟草品种遗传多样性研究[J].中国农学通报,2009,25(1):56-62.

[5] 王凤龙,时 焦,钱玉梅,等.烟草种质资源对黄瓜花叶病毒抗性鉴定研究[J].中国烟草科学,2000(3):1-4.

[6] BINDLER G,HOEVEN V R,GUNDUZ I, et al. A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theo Appl Genet,2007,114(2):341-349.

摘要:采用SSR分子标记分析了五峰7个主栽烟草(Nicotiana tabacum L.)品种。结果表明,6对引物共检测到22个多态位点,7个品种的遗传相似系数为0.347 8~0.913 0。

关键词:SSR分子标记;烟草(Nicotiana tabacum L.);马里兰烟

中图分类号:S572 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2014)06-1440-02

Analysis of SSR Molecular Marker in Maryland Tobacco

CHEN Yun,CHEN Lei,YUE Chao-yin

(Three Gorges University Biotechnology Research Center,Yichang 443002,Hubei,China)

Abstract: 7 tobacco cultivars were analyzed by SSR molecular marker. The results showed that the 6 primer pairs amplified a total of 22 polymorphic alleles. The genetic similarity (GS) of 7 tobacco cultivars was ranged from 0.347 8~0.913 0.

Key words: SSR molecular marker; Nicotiana tabacum L.; Maryland tobacco

烟草(Nicotiana tabacum L.)是世界性的经济作物,也是湖北省宜昌市五峰县的重要经济作物之一。烟草育种面临着遗传背景狭窄等问题,种质资源多样性是选育优良烟草品种的基础,传统的种质资源鉴定方法有形态鉴定、蛋白质及同工酶鉴定等[1],但这些方法操作复杂,常用的分子标记技术有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR等[2-4],其中SSR分子标记具有多态性高、共显性遗传、多等位基因、信息量高等优点[5]。本研究利用SSR分子标记技术,鉴定了湖北省宜昌市五峰县的6份马里兰烟及1份烤烟的种质资源,为充分利用马里兰烟种质资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以湖北省宜昌市五峰县的7个烟草品种为材料,包括五峰1号、五峰2号、Md01、Md02、Md30、Md40和NC89,其中NC89为烤烟。烟草种子由湖北省宜昌市烟草局提供。

1.2 DNA的提取

供试材料温室育苗,当幼苗长至5~6片叶时,取0.1 g叶片,用无菌水洗去叶表面的虫子,然后用液氮充分研磨。采用改良的CTAB法提取烟草的基因组DNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检测后,于-20 ℃保存备用。

1.3 SSR分析

试验所用SSR引物序列参考文献[3-5]中的引物。PCR扩增总体积20 μL,包括10×PCR缓冲液2 μL, dNTPs 0.4 μL,Taq 酶 0.2 μL,上、下游引物各0.6 μL,基因组DNA 2.0 μL,ddH2O补至20 μL。PCR 反应程序为:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,52 ℃退火 45 s,72 ℃延伸50 s,33个循环;72 ℃延伸10 min,最后4 ℃保存。PCR扩增产物先以1%琼脂糖凝胶检测扩增产物有无,再以6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,以1×TBE作缓冲液180 V恒压进行电泳,电泳时间75 min后进行银染,并拍照记录。

1.4 数据分析

PCR扩增产物按同一位置上条带在各个材料中的有清晰图谱且可重复出现的记为“1”,同一位置上无条带的记为“0”。应用软件NTsys Version 2.10,以共有DNA片段比例(软件中参数为DICE)作为指标,计算供试材料间的相似系数。采用非加权类平均法UPGMA(Unweighted Pair-Group Average)进行聚类分析。

2 结果与分析

通过对30对SSR引物进行筛选,选出6对反应稳定、多态性较好的引物,6对SSR引物共检测到22个多态位点(图1),每对引物3~5个,其中引物M1检测到6个多态位点,PT20372检测到4个多态位点,使用这种鉴别能力高的引物能将所有供试品种分开。五峰1号和Md02遗传相似系数最大为0.913 0,五峰2号和NC89的遗传相似系数最小为0.347 8,不同品种的马里兰烟遗传相似系数为0.478 3~0.913 0(表1)。

聚类分析(图2)显示五峰1号和Md02为一组,五峰2号和Md01为一组,Md30和Md40为一组,NC89为区别于马里兰烟品种的另一类群。

3 小结与讨论

SSR分子标记应用于烟草种质鉴定的起步较晚,Binder等[6]首次公开报道了烟草SSR分子标记的研究工作,并建立了第一张微卫星连锁图。本研究采用SSR分子标记技术分析了7个烟草品种。结果发现6对引物具有较好多态性,能将这7个品种完全区分开,表明将其他品种多态性好的SSR引物应用在构建马里兰烟遗传图谱上是可行的。聚类分析结果将马里兰烟和烤烟划分为两大类群,这一点与实际的种质资源相符,也证明了SSR分子标记用于烟草类型划分的可行性。

参考文献:

[1] LIANG M, LIU Y, ZHOU X, et al. Studies on protein fingerprints for identification of nicotiana varieties[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences,2000(2):16.

[2] 罗 冉,吴委林,张 旸,等.SSR 分子标记在作物遗传育种中的应用[J]. 基因组学与应用生物学,2010,29(1):137-143.

[3] 徐 军,刘艳华,任 民,等.普通烟草种质资源的SSR标记与指纹图谱分析[J].中国烟草科学,2011,4(32):2.

[4] 叶兰钦,辛明明,杜金昆,等.SSR标记应用于烟草品种遗传多样性研究[J].中国农学通报,2009,25(1):56-62.

[5] 王凤龙,时 焦,钱玉梅,等.烟草种质资源对黄瓜花叶病毒抗性鉴定研究[J].中国烟草科学,2000(3):1-4.

[6] BINDLER G,HOEVEN V R,GUNDUZ I, et al. A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theo Appl Genet,2007,114(2):341-349.

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