川芎嗪对实验性骨关节炎模型大鼠关节液中NO和PGE2的调节作用

梁桂洪，孙 赫，黄宇新，林勇凯，梁祖建

（1.广州中医药大学第三临床医学院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学附属骨伤科医院，广东 广州 510240）

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是骨伤科临床上的常见病和多发病，主要表现为关节疼痛、僵硬、功能障碍，其主要病理特征是关节软骨发病缓慢，渐进性退变，是一种严重影响老年人健康的疾病，其在力学因素和生物学因素的共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质、软骨下基质3者降解和合成失衡[1]。目前骨关节炎的发病机制仍不确切[2]。在其病理进程中，NO参与了炎症反应。在关节软骨降解中，PGE2是最主要的分解代谢因子之一[3]，并参与炎症反应、致痛、影响血管扩张及生成，从而产生症状。有中医学者认为气滞血淤是OA发病机制之一，川芎是一种广泛应用于临床治疗的常用中药，具有活血行气、祛风止痛的作用，川芎嗪为川芎的主要有效成分，现代研究表明其具有清除氧自由基、钙拮抗、扩血管、抗血小板聚集和血栓形成等多种作用[4]。已有学者用川芎嗪关节腔内注射治疗膝骨关节炎，长期疗效较为可靠[5]。本研究拟通过测定OA大鼠模型膝关节液中NO、PGE2的含量，探讨川芎嗪在减缓OA炎症的发生发展中的作用机制，为临床上治疗OA提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级健康雌性SD大鼠24只，体重180g～220g，由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 NO、PGE2试剂盒，广州齐云生物技术有限公司产品。

1.1.3 药物制备 盐酸川芎嗪注射液20mg／mL，无锡市第七制药有限公司产品（批号：H32023383），参照临床，剂量为每天7.19mg／kg，采用关节腔注射；氯化钠注射液，上海华原股份有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将动物随机分为假手术组、OA模型空白组、川芎嗪组，每组8只，用100g／L水合氯醛溶液按3.5mL／kg腹腔注射，5min后完全麻醉，OA模型空白组和川芎嗪组经背部切口切除大鼠双侧卵巢，切断右膝内侧副韧带及交叉韧带，行抽屉试验阳性后彻底止血，逐层缝合；假手术组经背部切口将大鼠卵巢从腹腔提出，仅切除卵巢周围少量脂肪，不切除卵巢，切开右膝关节处皮肤，不做其他处理后即缝合。所有伤口在缝合前均滴入少量的青霉素溶液。术后连续4d肌肉注射青霉素4万单位／d。第5天起每天驱赶动物奔跑30min，其余时间任其笼内自由活动。

1.2.2 治疗方法 术后4周开始每次给川芎嗪组关节腔注射盐酸川芎嗪注射液0.36mL／kg。OA模型空白组、假手术组关节腔注射等量的生理盐水，每周2次，连续注射4周。

1.2.3 饲养环境 术后分笼饲养，所有SD大鼠均喂养在恒温、恒湿的清洁环境中，环境温度为25℃±1℃，湿度为68%，每天12h光照／黑暗，任意进食饲养者提供的大鼠标准饲料和自来水。

1.2.4 观察指标 各组于术后第4、8周抽取各组关节液进行NO、PGE2含量测定。

1.2.5 指标检测方法 NO、PGE2检测，参照试剂盒方法进行操作。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（¯x±SD）表示，多组比较符合正态性和方差齐性用方差分析，不符合正态性或方差齐性用非参数检验；计数资料以率或构成比表示，采用X2检验；等级资料采用非参数秩和检验。所有统计检验均采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 关节液中的NO含量测定

术后4周，OA模型空白组与川芎嗪组关节液中的NO较假手术组明显升高（P＜0.01），OA模型空白组关节液中的NO与川芎嗪组比较无统计学差异（P＞0.10）；术后8周OA模型空白组关节液中的NO较假手术组明显升高（P＜0.01）；术后8周川芎嗪组关节液中的NO较术后4周明显减少（P＜0.01）；术后8周川芎嗪组关节液中的NO较OA模型空白组明显减少（P＜0.05）；术后8周川芎嗪组关节液中的NO与假手术组比较无统计学差异（P＞0.10）（表1）。

2.2 关节液中的PGE2含量测定

术后4周，OA模型空白组与川芎嗪组关节液中的PGE2较假手术组明显升高（P＜0.01）；OA模型空白组关节液中的PGE2与川芎嗪组比较无统计学差异（P＞0.10）；术后8周PGE2模型空白组关节液中的PGE2较假手术组明显升高（P＜0.01）；术后8周川芎嗪组关节液中的PGE2较术后4周明显减少（P＜0.01）；术后8周川芎嗪组关节液中的PGE2较OA模型空白组明显减少（P＜0.05）；术后8周川芎嗪组关节液中的PGE2与假手术组比较无统计学差异（P＞0.10）（表2）。

表1 术后4周、8周关节液中的NO含量测定Table1 Determination of NO content in the fluid within joints after operation 4weeks and 8weeks μmol／L

表2 术后4周、8周关节液中的PGE2含量测定Table2 Determination of PGE2content in the fluid within joints after operation 4weeks and 8weeks μmol／L

3 讨论

据世界卫生组织调查[6]，骨关节炎的发病人口已达10%左右，其发病率和年龄成正相关。OA的发病机理非常复杂，至少远未达到可以研究清楚的程度，而滑膜炎症与关节退变在本病的发生发展过程中占有重要的地位。研究表明OA发生时，各种细胞因子及软骨降解产物的强烈刺激使NO水平升高，而过多的NO不但可协同其他细胞因子增加软骨损害，而且可增强基质金属蛋白酶的活性，促进软骨蛋白聚糖和胶原的裂解[7]。NO的大量释放又进一步促进炎性细胞因子释放，从而抑制软骨细胞分泌细胞外基质，影响Ⅱ型胶原合成[8]，最终导致软骨的质量因营养障碍，不断下降和进行性退化。反之，NO还可促进IL－1介导软骨降解作用，减少软骨细胞合成IL－1Ra，影响基质生物合成。而且NO在滑膜炎的形成中也起着重要的作用，滑膜中高含量的NO可引起滑膜组织的损伤和血管扩张、血管壁的通透性增大而引起渗出，导致滑膜肿胀、充血及关节内的粒细胞渗出，形成关节积液，从而引起关节的肿胀、疼痛。另外，NO还可导致软骨细胞发生凋亡[9]。PGE2是由活化磷脂酶 A2 （phospholipase A2，PLA2）分解膜磷脂产生花生四烯酸氨基酸，在环氧化酶（cyclooxygenase，COX）和前列腺素E合成酶（prostaglandin E synthase，PGES）作用下形成的。炎性介质IL－1和TNF－α能诱导和激活PLA2，活化花生四烯酸代谢途径，促使PGE2合成增加。PGE2还可舒张小血管，增加微循环通透性.增加渗出与水肿，诱导白细胞聚集，加重滑膜炎症反应，并参与软骨下骨重塑[10]，PGE2又可进一步加强IL－1对软骨的分解作用，使滑膜细胞与浸润性炎性细胞反应性增强。同时PGE2通过细胞间环腺苷酸积累，直接诱导软骨细胞凋亡，增加破骨细胞形成，促进骨吸收。有研究表明，临床上可以通过抽取并检测膝关节液中MMP－3和PGE2的含量，作为早期诊断OA的重要指标[11]。由此可见，NO、PGE2对OA疾病发生发展及病理过程具有重要的影响。

川芎是一种广泛应用于临床治疗的常用中药，具有活血行气、祛风止痛的作用，被誉为血中之气药。川芎嗪来源于伞形科植物川芎（Ligusticum wallichii）的干燥根茎，其化学结构为四甲基吡嗪，具有典型的钙离子拮抗剂的特性。研究表明川芎嗪有解痉、强烈抑制血小板凝集、扩张血管、改善微循环、降低全血黏度、改善血液流变学、清除自由基、抑制细胞凋亡、抗炎消肿、降低心肌耗氧等多种作用[4]。现代医学认为OA的病因与骨内静脉淤滞、骨内高压有密切联系，活血化瘀类药物具有改善骨内血液流变学和血流动力学状态，降低骨内高压，改善骨内微循环的作用，能从根本上治疗本病。柯高峰等[12]通过比较活血法、温经法、补肝肾法和活血温经补肝肾法对膝骨关节炎滑膜中NO、TL－6浓度的影响，发现活血药更能抑制OA早期模型滑膜中NO、TL－6的浓度，更能缓解关节炎发展，对于缓解骨关节炎的临床症状的效果更好。而且川芎嗪治疗OA的临床与试验研究已有相关报道。王文瑞等[13]观察了川芎嗪对膝关节骨关节炎软骨退变的保护作用，发现川芎嗪改善了关节周围组织的血液淤滞状态，使血流畅通，局部组织的理化环境恢复正常，提高关节软骨SOD活性，纠正了氧自由基代谢紊乱。王锁良等[14]通过比较激素类药物以及川芎嗪关节腔内注射对骨关节炎过程中软骨退变的作用，发现关节腔内注射川芎嗪能减轻兔膝关节炎模型的关节软骨退变程度，并可促进软骨的自身修复。何建新等[15]通过试验研究表明川芎嗪可通过刺激TIMP－1的合成，降低软骨基质中 MMP－13mRNA表达，延缓了软骨细胞的退变和基质的降解，从而起到了防治骨性关节炎的作用。洪昆达[16]通过研究发现，关节腔注射川芎嗪后可能是通过调节机体炎症因子的表达，以及促进软骨细胞增殖与抑制软骨细胞调亡，起到保护软骨的作用，从而有效地缓解了疲血阻络型膝骨性关节炎患者的临床症状。张卓等[17]通过研究发现川芎嗪可能是通过抑制了MMPs的活性，抑制软骨基质中蛋白多糖的丢失过程，从而起到抑制关节退变的作用。为此，本研究选用了川芎嗪作为治疗药物。

本试验研究结果显示，术后8周，关节液中NO、PGE2的水平在川芎嗪组中表达均较OA模型空白组及术后第4周川芎嗪组明显减弱（P＜0.05，P＜0.01）；OA模型空白组及川芎嗪组关节液中的NO、PGE2均较假手术组明显升高（P＜0.01）；术后8周川芎嗪组关节液中的NO、PGE2与假手术组比较均无统计学差异（P＞0.10）。因此，我们推测川芎嗪能通过抑制NO、PGE2的生成从而缓解了OA炎症的发展，对OA起到抗炎、镇痛的防治作用。综上所述，关节腔注射川芎嗪治疗OA效果可靠，操作简便，值得临床推广应用。有关剂量效应关系和时间效应关系的对照研究、动态的观察川芎嗪对OA炎症发生发展进展的影响和最佳治疗剂量，有待于进一步研究。

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