高脂饮食诱导的肥胖及肥胖抵抗小鼠肠道菌群元基因组的比较研究

王 欢，李宛真，汪弋力，胡玲香，丁维俊

(成都中医药大学基础医学院，四川成都 611137)

肥胖病是由于体内脂肪堆积过多和(或)分布异常，造成体重增加的一种慢性代谢紊乱性疾病[1]，现已成为世界范围内患病排名的第6位，是世界关注的重大公共卫生问题[2]。在集中研究已肥胖个体之外，近年来研究者也开始关注食用高脂肪食物却不肥胖的人群。LEVIN等[3-4]发现，高脂饮食可诱导肥胖发生，但不同个体对高脂饮食诱导产生肥胖的易感性却存在差异，发生肥胖者称为饮食诱导肥胖(diet-induced-obesity, DIO)，不发生肥胖者称为饮食诱导肥胖抵抗(diet-induced-obesity-resistant, DIO-R)。虽然肥胖的病因及发病机制尚未完全清楚，但近年来国外有研究发现被视为人类“第二基因组”的肠道菌群与肥胖的发生有着密切关系[5-7]，并被越来越多的实验研究所证实[8-10]。为了探究DIO与DIO-R中肠道菌群的差异，深入认识两者的发生与人体内微生物群落之间的关系，为寻找有效的防治肥胖措施提供依据，本研究通过给予小鼠高脂饮食建立肥胖及肥胖抵抗模型，比较DIO、DIO-R和普通小鼠肠道菌群元基因组水平，并间接了解肥胖的发生与肠道菌群变化的关系。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级雄性C57BL/6J小鼠40只，鼠龄8周，体质量(20±3.5)g，购于四川大学实验动物中心。清洁级标准饲养。

1.2模型建立高脂饲料参照文献[11]报道的肥胖造模方法，并稍加改进为：普通饲料60%、猪油12%、蔗糖5%、奶粉5%、花生5%、鸡蛋10%、麻油2%、食盐1%。委托北京华阜康生物科技股份有限公司生产。

将所有小鼠均适应性喂养普通饲料(SFP级鼠饲料)2周后，随机分为2组：模型组30只，喂食高脂饲料；正常组10只，继续喂食普通饲料。造模期间所有小鼠均自由摄食、饮水，饲料和水每日更换1次，每周称量小鼠体重1次。造模8周后，按体重增长率超过正常组平均体重增长率的1.96个标准差为肥胖小鼠的判定标准[3]，从模型组中筛选出符合标准的DIO小鼠21只，其余作为DIO-R小鼠组，共8只。

1.3样品采集与处理采用腹部按摩法收集小鼠0.1～0.3 g粪便，按照柱式粪便DNA out试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)说明书操作，立即提取粪便菌群基因组DNA。提取后的DNA均保存于-20 ℃。所检测标本包括3个：正常组(N组)：健康对照鼠实验过程中3次取大便，立即提取DNA，经检验合格后，每个DNA样本各取15 μL，混合而成。DIO组(M组)：造模成功小鼠，取样4次，立即提取DNA，经检验合格后，每个DNA样本各取10 μL，混合而成。DIO-R组(C)：肥胖造模不成功小鼠，即DIO-R组小鼠，取样3批次，立即提取DNA，经检验合格后，每个DNA样本各取15 μL，混合而成。

1.4肠道菌群元基因组的测定将提取基因组DNA送深圳华大基因研究院，经检测合格后，采用Illumina公司的Hiseq2000分析3个样本的肠道元基因组物种组成，此步骤委托深圳华大基因研究院完成。

1.5统计学处理采用SPSS 17.0统计软件完成，对小鼠体质量比较差异的检验水准α=0.05。

2结果

2.1造模开始前及成功后3组小鼠体质量的变化造模开始前，3组小鼠体质量无差异(P>0.05)；造模开始8周后，DIO组体质量与正常组体质量比较有统计学差异(P=0.000)，其体质量增长率超过正常组平均体质量增长率的1.96个标准差，造模成功；DIO-R组小鼠与正常组体质量比较无差异；DIO组体质量与DIO-R组体质量比较有统计学差异(P<0.01，表1)。

表1 各组小鼠体质量的变化

与正常组比较*P<0.01； 与DIO组体质量差比较，#P<0.01。

2.2基因注释结果ORFs与NR、eggNOG、KEGG数据库比对的统计结果见表2。每个样品的物种注释中约72%以上的ORF注释到门及以下级别，但仍有20%以上的ORF未注释到物种库，以DIO组最高(23.25%)，说明其中有很多物种仍待发掘。且在eggNOG、KEGG数据库功能注释中，很大一部分基因未完善功能定义，以DIO组的未知功能为最多。

表2 物种注释及功能注释结果统计表

注：ORF物种注释统计的是在门级别信息，Unknown 为未比对上物种库的ORF；Unclassified 为比对上物种库，但未注释到门及以下级别的ORF； Classified 为能注释到门及以下级别 ORF；功能注释包括eggNOG 注释信息、KEGG Orthology 注释信息和 Pathway注释信息，Annotated为注释到该功能ORF，Unannotated为未注释到该功能的ORF。

2.3ORFs与KEGG数据库比对的基因功能注释结果KEGG数据库的主要功能之一是提供分子相互作用和代谢通路图，每张通路图可由4个层次的分类组成。先通过KEGG Orthology数据库比对注释得到第1层功能分类，针对第1层每个功能分类进行系统分类为2、3、4层。其中第2层目前包括有39种子功能；第3层即为其代谢通路图；第4层为每个代谢通路图的具体注释信息。将其在前两个层次的功能分类进行统计并绘制柱状图(图1)，可直观显示代谢功能分布情况。从KEGG数据库比对的基因功能注释结果所注释到的基因功能主要分布于代谢(metabolism)、基因信息处理(genetic information processing)、环境信息的处理(environmental information processing)和细胞的加工处理(cellular processes)4个区域。在代谢途径的12个子功能中，DIO组执行多糖代谢、氨基酸代谢的基因数均较低于DIO-R组；在基因信息处理的子功能中，DIO组执行基因信息翻译的基因数低于DIO-R组；在环境信息处理的子功能中，DIO组执行信号转导的基因数显著高于DIO-R组；在细胞能动性上，DIO组基因数亦明显高于DIO-R组。其余代谢功能无明显差异。正常组小鼠肠道菌群中执行代谢功能的基因数均明显多于DIO组和DIO-R组，尤其是调控核苷酸代谢、脂肪代谢、多糖代谢、能量代谢、碳水化合物代谢、氨基酸及相应酶的代谢的基因；基因信息处理的子功能中，正常鼠中执行转录、翻译、复制与修复、折叠、排序和降解基因数亦明显高于DIO组和DIO-R组；而在执行信号转导、细胞能动性基因数上，正常组处于DIO组与DIO-R组之间。

图1 各组的KEGG二级代谢的注释结果

2.4ORFs与eggNOG数据库比对的基因功能注释结果将ORFs与eggNOG数据库比对的基因功能注释结果绘制成柱状图(图2)，可直观地看出代谢功能分布的情况：虽然注释到每个功能的基因数与KEGG注释的结果略有差异，但执行每个功能的基因数在3组中的变化情况与KEGG注释中的变化情况一致，即DIO组中执行E(氨基酸转运和代谢)、J(翻译)功能的基因数较低于DIO-R组；而执行N(细胞能动性)、T(信号转导)功能的基因数显著高于DIO-R组。正常组与两组各功能基因数差异的变化趋势同KEGG注释中的情况一致。

2.5ORFs的物种注释结果根据物种注释结果对所有基因进行统计，并计算肠道菌的门级别水平的基因在该样品中的比例。DIO组变形杆菌门较DIO-R组高近16%,类杆菌门较DIO-R组与正常组明显下降，降低将近20%；厚壁菌门较DIO-R组升高8%，类杆菌/厚壁菌的比值较DIO-R组与正常组明显下降。DIO-R组变形杆菌门约为正常组的1/2；其余无明显差异。DIO组放线菌门也稍有增高(表3)。

图2 各组的eggNOG注释结果的功能大类

表3 肠道菌群门级水平相对百分比含量

注：其他为含有基因个数较少的门的集合；NA为未注释上门级别的基因。

3讨论

LEVIN等[3-4]在实验中观察到，同一品系、同一批大鼠食用相同的高脂饲料，其中部分大鼠发生肥胖，部分大鼠不发生肥胖，由此开启了DIO与DIO-R的对比研究。本实验在高脂饲养C57BL/6J小鼠8周末，已有大部分小鼠表现出明显肥胖，而DIO-R小鼠体重与正常组没有差别，这与文献[12]报道的一致。

越来越多的研究证实了肠道菌群与肥胖的相关性[13]。有研究证实，不同饲料喂养的动物，其肠道菌群组成有所差异[14-15]。由于大多数微生物目前还难以在实验室分离和培养[16]，故本实验采用Illumina高通量测序技术，对3组小鼠肠道菌群进行了元基因组的检测，通过与3类蛋白库的对比，基因注释结果显示：DIO小鼠与DIO-R小鼠肠道菌群在执行多糖代谢、氨基酸代谢、基因信息翻译、信号转导、细胞能动性多种功能基因数上有差异，且两者较正常组相对应功能的基因数显著降低。这与相关文献报道的肥胖患者肠道菌群有很高的物质代谢能力，提高了机体对食物的能量收获率相矛盾[17-18]。这可能是本实验中各组小鼠数量较少且动物间有种属差异以及3个样品的功能注释中的未知部分，可能对肠道细菌基因功能认识有严重缺陷[19]。另外，机体肠道微生态系统中的一个主要代谢功能为对膳食中难消化物质的发酵，其产生的能量和营养物质除了可供宿主吸收利用外，也供给菌体自身的生长繁殖、代谢。因此，可能其代谢能力增强并不一定意味着宿主可以吸收更多能量而导致肥胖的发生。本实验中正常组小鼠代谢能力明显高于肥胖组的结果也可说明，同时提示DIO及DIO-R都处于不健康的代谢紊乱状态，但尚需实验研究进一步证实。

研究表明，高脂饮食会使肠道菌群养料来源(主要是未被小肠消化吸收的碳水化合物)的生成减少，导致短链脂肪酸的生成减少，从而使血脂的调节功能受到抑制[20]，而且高脂饮食代谢的副产物也会破坏菌群赖以生存的微环境[21]，影响肠道菌群的生态平衡，导致正常的肠道菌群紊乱。本实验在对样品代谢核心菌群分析的结果显示，DIO组类杆菌/厚壁菌的比值较DIO-R组和正常组明显下降，变形杆菌门较DIO-R组高近16%，DIO-R组变形杆菌门约为正常组的1/2。变形杆菌门属革兰氏阴性杆菌，通过产生内毒素，参与肥胖的发生[22-23]。本实验结果显示，DIO小鼠肠道菌群中变形杆菌门升高及DIO-R变形杆菌门下降。将物种注释结果与功能注释结果比对后可知，DIO小鼠肠道菌群厚壁菌升高，类杆菌降低后，反而代谢能力随之降低，这与KALLUS等[24]报道的厚壁菌门相对于类杆菌门能产生相对完全的能量代谢，促进吸收更多的热量，维持肥胖的进程的结果似乎相矛盾。故本实验尚需改善实验方案，并重复验证。另外，对在物种注释结果中25%～28%的未知微生物基因也有待进一步研究。

随着人们物质生活水平的不断提高和膳食模式的改变、运动量的日益减少，超重、肥胖的患病率越来越高；而与肥胖相对立的肥胖抵抗状况的存在，从对立面为解决肥胖问题提供了新途径，也应获得足够重视。深入探讨饮食诱导肥胖与肥胖抵抗时肠道菌群差异的分子水平作用机制以及对肠道菌群种类的研究及调整，将有重要意义。

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