近红外光谱对市售黄芩饮片中黄芩苷含量的快速测定
2014-06-27杨文娟高玲童
杨文娟， 李 楠， 李 华， 高玲童
(1.陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021; 2.咸阳市食品药品检验所， 陕西 咸阳 712000)
0 引言
黄芩为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensiGeorgi)的干燥根[1]，主产于河北、河南、内蒙古及陕西等地，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎之功效，主治上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄疸、胎动不安等症[2].黄芩饮片除临床汤剂应用外，也是三黄片、银黄颗粒、双黄连口服液等中成药生产原料的主要形式.黄芩中主要活性成分为黄芩苷，目前在治疗动脉粥样硬化、缺血性脑损伤等方面具有较好的治疗效果[3-5].但黄芩苷在加工、储藏条件不当的情况下，极易被水解为黄芩素，致使疗效降低[6].
董历华[7]等调查了全国16个省市72家医疗机构的黄芩饮片的等级，测定了黄芩苷含量，结果显示在南北医疗机构之间、城乡医疗机构之间、各级别医疗机构之间、不同规格等级之间，黄芩饮片的质量均存在较大差异.
近红外光谱是近年来应用于多个领域的新技术.近红外光谱波长范围在780～2 500 nm之间，有机化合物在该区可被吸收，其特点是吸收较弱，样品不需稀释就可测量，适于组分的常量分析，且易于实现简便快速的非破坏分析[8].
本文采用近红外光谱技术，建立测定黄芩饮片中黄芩苷含量的定量分析模型.该定量分析模型具有较高的预测精度，为中药饮片有效成分的检测提供了一种简便、快速、无损的测定方法.
1 仪器与材料
(1)主要仪器：Vector 22/N型傅里叶近红外光谱仪(德国布鲁克公司)；1200LC型高效液相色谱仪(安捷伦公司).
(2)主要材料：黄芩饮片，购自河北、山东、广西、河南、陕西等12个不同地区的零售药店及医院药房，共计42份.并经陕西中医学院雷国莲教授鉴定为唇形科植物黄芩(ScutellariaBaicalensiGeorgi)干燥根加工而成的饮片;黄芩苷对照品,由中国药品生物制品检定所(110715-201013)提供.
2 方法与结果
2.1 HPLC测定黄芩苷含量[9]
取黄芩饮片约0.5 g，精密称定，加70%乙醇50 mL，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置50 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀.精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液.
精密称取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成浓度为0.05 mg/mL的溶液，分别取2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、15μL、20μL注入液相色谱仪，以甲醇∶水∶磷酸(55∶45∶0.2)为流动相，流速为1 mL/min，检测波长为280 nm，记录峰面积.以黄芩苷质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.线性方程为y=5 339.4x+120.76(R2=0.999 0)，黄芩苷在0.1～1.0μg之间线性关系良好.将42份供试品溶液各吸取20μL注入液相色谱仪，测定，计算得到黄芩饮片中黄芩苷含量.
黄芩苷对照品和黄芩饮片样品分离的色谱图见图 1所示.
a:黄芩苷对照品; b:黄芩饮片样品图1 黄芩苷对照品及黄芩 饮片样品的HPLC图
2.2 近红外光谱采集
将42份黄芩饮片在50 ℃下干燥，粉碎，过80目筛，称取10 g粉末放入石英样品杯中，混合均匀，轻轻压平，按下述实验条件进行扫描：
本研究以生态语言学理论、建构主义理论、ESP理论等为理论依据，采用调查、文献、比较等研究方法，并遵循以下思路开展研究。先调研分析高职公共英语教学现状及其所存弊端，提出其改革需融入EOP的必要性；再分析融入EOP后原高职公共英语教学生态失衡产生的失调现象及不良影响，论证重构融入EOP的教学生态的可行性；然后明晰改革思路，开发EOP教学资源，开展考核学生英语应用能力的多元评价，加强EOP师资建设，实现高职公共英语教学生态再平衡；最后总结研究成果，并在其他高职推广。具体研究如下三大内容。
测样方式为积分球漫反射，采集光谱范围为10 000～40 00 cm-1，以金背景为参比进行扫描，扫描次数为32次，分辨率为8 cm-1.每份样品采集3张图谱，42份样品的平均叠加图见图2所示.
从图2可以看出，42份样品的近红外原始图谱基本一致，很难看出药材的光谱信息差别.该原始光谱无法直接用于黄芩苷的定量分析，需要进一步进行光谱处理[10].
图2 42份样品的近红外光谱图
2.3 建立黄芩饮片中黄芩苷的近红外定量模型
2.3.1 校正集与预测集的选择
应用OPUS/QUANT2定量分析软件中PLS法进行数据处理，得到样品的NIR主成分得分图，见图3所示.根据主成分得分图，将42份样品分成32个校正集样品和10个预测集样品.预测集样品较均匀地分布于校正集样品之中，见图4所示.
图3 42份样品的主成分得分图
图4 10份预测集样品的主成分得分图
2.3.2 建模谱段的选择
PLS法可允许处理全谱信息，但从不同谱段RMSECV和R2来看(见表1所示)，选择4 612～4 224.5 cm-1时，RMSECV较小，R2较大.结合光谱图和软件自动优化功能，选择谱段4 612～4 224.5 cm-1建模[11].
表1 光谱范围的选择对RMSECV和R2的影响
2.3.3 主因子数选择
模型的主因子数对预测结果有较大影响.如果PLS所用的主因子数太少，光谱中一些有用的信息尚未被包含而导致模型预测能力欠佳；反之，选择的主因子数过多，则会出现过拟合现象而影响其结果[12].采用内部交叉验证法，根据RMSECV随主因子数的变化图选择主因子数为9，见图5所示.
图5 交叉检验最佳主因子数图
2.3.4 建立模型
运用OPUS定量分析软件中设定的方法进行数据处理，将多种预处理方法进行比较.结果显示，最小最大归一化法为最优处理方法，见表2、图6所示；近红外光谱法测定值与真实值之间吻合较好，R2为0.896 1，RMSECV为0.836，见图7所示；绝对误差在-1.75%～1.25%之间,见图8所示.其中，真实值是用HPLC对样品进行测定的结果，测定值是指运用近红外光谱方法对样品进行测定的结果.
表2 光谱预处理优化结果
图6 42份样品最小最大归一化法 处理后的近红外图谱
图7 校正集真实值与预测值关系图
图8 校正集绝对误差与真实值关系图
2.3.5 模型验证
取10份验证集光谱，验证所建定量模型的适用性.验证结果见表3所示.经计算可以得到预测集平均误差为0.92%.可以看出，预测结果较为准确，说明模型建立成功.
表3 验证集样品预测结果
3 结论
黄芩饮片为临床常用中药，其主要活性成分黄芩苷含量的高低是决定疗效的关键因素.在医药市场中，存在大量样品需要检测，但黄芩苷常规测定手段分析时间长、消耗有机试剂多、操作繁琐.而近红外光谱为中药质量快速评价提供了一种新技术，它能够间接预测含量.
本文应用PLS方法结合NIR光谱，建立了测定黄芩饮片中黄芩苷含量的定量分析模型.模型经过校正集样品的内部交互验证和预测集对模型预测能力的检验，选择最小最大归一化法的光谱预处理方法和最适的主因子数，得到了最优的定量分析模型.
黄芩苷的定量模型参数为RMSECV为0.836，R2为0.896 1.其中，R2为相关系数，其值越接近1，就说明真实值与模型预测值越接近，模型的准确度也就会越高；RMSECV为交叉检验均方差，它的值越接近0，说明模型预测值偏差越小.
RMSECV和R2是评价模型建立是否成功的重要参数，本实验中这两项指标的结果均较理想.以10份黄芩样品进行预测，其预测平均偏差为0.92%，预测结果较准确.由此可知，近红外光谱可用于市售黄芩饮片中黄芩苷含量的快速测定，方法可行，方便快捷，不用前处理，无破坏性，在中药饮片质量分析中具有广泛的应用前景.
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：282．
[2] 李倩楠，葛晓群.黄芩苷及黄芩复方制剂解热机制研究进展[J].国际药学研究杂志，2008，35(5)：342-345，363.
[3] 史亚军，施俊辉，陈世彬，等.黄芩苷治疗缺血性脑损伤研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(7):218-222.
[4] 徐 昕，颜小华.黄芩苷治疗脑损伤的研究进展[J].实用临床医学，2012，13(8)：131-133，136.
[5] 顾琼琼，刘向群.黄芩苷对动脉粥样硬化作用机制的研究进展[J].中国老年学杂志，2011，31(22)：4 501-4 503.
[6] 李 丽，张 村，肖永庆，等.黄芩饮片的产地加工方法研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(8)：1-3.
[7] 董历华，王 璞，马长华.医疗机构的黄芩饮片质量调查分析[J].中国药房,2012,23(43)：4 118-4 120.
[8] 王桂梅，臧恒昌．近红外光谱技术及其在药学领域的应用进展[J]．广州医药，2008，39(2)：7-9.
[9] 李贵波，王欣欣，刘秀华，等.正交试验法优选黄芩炮制工艺[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(6):36-38．
[10] 范铭然，孟庆繁，王 迪，等．近红外光谱-偏最小二乘法快速测定八角茴香中莽草酸含量[J].时珍国医国药，2009，20(5)：1 199-1 200．
[11] 李晓光，关泽华，田鸿儒，等．基于偏最小二乘法的近红外光谱定量分析模型预测蛹虫草中腺苷的含量[J]．时珍国医国药，2009，20(10)：2 612-2 614．
[12] 雷敬卫，李 磊，白 雁，等．丹参药材丹酚酸B含量的NIR快速检测[J]．时珍国医国药，2013，24(4)：1 007-1 008．
