小鼠17β-hsd10的克隆、表达及双抗夹心ELISA方法的建立

刘传志，牛莹莹，陈元安，武成，于源华

长春理工大学生命科学技术学院，吉林长春130022

小鼠17β-hsd10的克隆、表达及双抗夹心ELISA方法的建立

刘传志，牛莹莹，陈元安，武成，于源华

长春理工大学生命科学技术学院，吉林长春130022

原核表达小鼠17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-hsd10），制备抗17β-hsd10多克隆抗体，建立17β-hsd10双抗夹心酶联免疫检测方法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。采用RT-PCR技术克隆得到小鼠肝脏17β-hsd 10基因，构建原核表达体系pET15b-17β-hsd10/Escherichia coli BL21(DE3)，IPTG诱导重组蛋白表达，并优化表达条件；目的蛋白用His融合蛋白纯化柱（His-Binding-resin）纯化并免疫BALB/c小鼠和新西兰大耳白兔，免疫血清总IgG采用硫酸铵沉淀法纯化，用获得的高效价鼠源和兔源两种多克隆抗体，建立17β-hsd10双抗夹心酶联免疫检测方法。表达蛋白约为29.5 kDa，纯化后浓度为1.5 mg/m L，鼠源和兔源多克隆抗体效价分别为1.25×104和2.5×104，建立的检测方法对于多种羟基类固醇脱氢酶无交叉反应，特异性良好，可检出含量约为0.05−0.1µg/m L的阳性血清。建立的17β-hsd10双抗夹心ELISA方法，简便、快速、敏感，适合实验室研究科研广泛应用。并可能为检测阿尔茨海默病提供新思路和方法。

17β-羟基类固醇脱氢酶10，双抗夹心酶联免疫方法，多克隆抗体

17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-hsd10)属于短链脱氢酶超家族(SDR)[1-3]，由17β-hsd10基因编码，参与脂肪酸β氧化，糖皮质激素和孕酮分解代谢及胆汁酸同分异构化作用[4-5]。最初，17β-hsd10被认为是3-羟氨基辅酶A脱氢酶-Ⅱ(SCHAD,HADH2)或内质网Aβ相关蛋白(ERAB)[6-8]，现已证实，人类的17β-hsd10与β-淀粉样蛋白(Amyloid-β，Aβ蛋白)具有中等亲和性[5]，它通过一个氨基末端紧密的靶作用信号定位于线粒体[9-10]。从人类17β-hsd10同Aβ蛋白结合的结构测定推断出Aβ蛋白的结合是特异的[11]。He等研究发现，在阿尔茨海默病(AD)转基因小鼠的突触海马体中存在17β-hsd10的富集现象[12]。Yang等的研究也证实，17β-hsd10参与大脑认知活动，在阿尔茨海默病患者和AD小鼠模型的脑中都检测到17β-hsd10的大量表达[13]。这些研究均揭示出17β-hsd10与阿尔茨海默病的相关性。

阿尔茨海默病(A lzheimer's disease，AD)即所谓的老年痴呆症，是一种致死性神经退行性疾病，据中国阿尔茨海默病协会2011年公布的调查结果显示，全球有约3 650万人患有痴呆症，平均生存期只有5.9年，是威胁老人健康的“四大杀手”之一。有研究认为，开始出现明显症状之前的几年甚至是几十年，阿尔茨海默病便已发病[14-17]。但是，目前为止，在患上AD的最早期(也就是出现明显症状之前)，还没有一种有效的方法能够将其发现。

目前，诊断AD的最佳生物标志物包括核磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)和脑脊液蛋白检测[18-19]。但是，这些诊断方法要么价格昂贵，要么会对患者带来极大的痛苦，一种更加快速、简便的AD诊断方法仍然是该领域研究人员不断追求的目标。

本文从小鼠肝脏中克隆得到17β-hsd10基因，原核表达小鼠17β-hsd10，制备抗17β-hsd10多克隆抗体，建立17β-hsd10双抗夹心酶联免疫检测方法(ELISA)[20-21]。可检出含量约为0.1−0.05µg/m L的阳性血清，有望成为AD的快速诊断新方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料

IPTG(Merck公司)，弗氏完全和不完全佐剂、咪唑等(Sigma公司)，His-Binding-resin纯化柱(上海悦克生物技术有限公司)，BALB/c小鼠、新西兰白兔由吉林大学动物室提供，96孔酶标板(Costar)，HRP标记的羊抗兔抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，DNM-9602酶标分析仪购自北京普朗有限公司。3α-hsd、11β-hsd、17β-hsd4、6的标准品购置于Sigma公司，组氨酸标签蛋白蛋氨酸-γ裂解酶(MGL)、pET-15b质粒及E.coli BL21(DE3)为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank上已登记的小鼠17β-hsd10基因序列以及表达载体的多克隆位点设计特异性引物，分别引入NdeⅠ和Bam HⅠ酶切位点(斜体带下划线)。引物序列如表1，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.2 17β-hsd10基因的克隆及表达

采用天根动物组织RNA提取试剂盒提取小鼠肝脏总RNA，随后采用RT-PCR试剂盒合成小鼠17β-hsd10基因cDNA第一链，以此为模板进行PCR扩增，反应条件：94℃，5 m in(94℃，2 m in；54℃，30 s，72℃，1 m in)循环30次；72℃，5 m in。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后回收，与pUCm-T连接后(pUCm-T-M 10)测序。

表1 小鼠17β-hsd10基因引物序列Tab le 1 Prim er sequence of 17β-hsd10 gene in m ouse

表2 17β-hsd10多克隆抗体免疫程序Tab le 2 Imm une Procedures of anti-17β-hsd10 polyclonal antibody

将pUCm-T-M 10与pET-15b分别用NdeⅠ和Bam HⅠ双酶切并回收，产物于22℃连接过夜后转化E.coli BL21(DE3)，小量提取质粒进行双酶切和PCR鉴定，阳性质粒命名为pET-5b-M 10，由上海生工测序。获得重组工程菌株在37℃，培养液pH值为8.0，诱导剂IPTG的浓度为0.5 mmol/L的条件下，振荡培养48 h，12%SDS-PAGE鉴定，亲和层析(Ni)柱纯化17β-hsd10蛋白。

1.2.3 抗17β-hsd10多克隆抗体的制备及纯化

用纯化后的17β-hsd10蛋白分3次免疫新西兰大耳白兔和BALB/c小鼠，每次间隔2周，第二、三次免疫1周后取血清，免疫程序如表2。

用ELISA法测定效价，以免疫前的血清作为阴性对照，阳性判定标准：P/N＞2.1记为阳性，抗体效价：阳性孔最大稀释倍数记为抗体效价。抗血清在13 000 r/m in，离心5 m in，收集上清。等体积生理盐水混匀滴加硫酸铵(体积分数50%)，用浓氨水调至pH值8.0，充分沉淀抗体。室温平衡后，离心，弃上清。重复此沉淀步骤2–3次。最后一次离心后所得沉淀物即为粗提IgG抗体。将此沉淀物溶于4–5 m L生理盐水中，装入透析袋4℃透析过夜。于–20℃保存。

1.2.4 双抗夹心ELISA方法的建立

以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释鼠源抗17β-hsd10多抗，包被酶标板，100µL/孔，4℃过夜；用洗涤液(含0.05%

1.2.5 特异性实验

用建立的ELISA方法检测含有3α-hsd、11β-hsd、17β-hsd4、7的标准品，并用实验室表达的His-标签蛋白蛋氨酸-γ裂解酶(MGL)做标签鉴定。同时设阳性、阴性和空白对照，进行交叉反应实验，以评价该方法的特异性。

1.2.6 敏感性实验

将已确定浓度的17β-hsd10梯度稀释(1：800、1：1 600、1：3 200、1：6 400、1：12 800、1：25 600、1：51 200、1：102 400、1：204 800)后，取100µL进行ELISA检测，确定所建立方法的最低检出浓度。

2 结果

2.1 17β-hsd10基因的克隆

应用设计的引物及RT-PCR技术扩增了小鼠17β-hsd10的全长cDNA，构建重组质粒pUCm-T-M 10，经NdeⅠ和Bam HⅠ双酶切，获得789 bp的条带，如图1，测序证实为目的基因。

2.2 17β-hsd10表达质粒的构建

构建的重组质粒双酶切及PCR鉴定结果分别如图2所示，质粒构建成功，对重组质粒pET-15b-M 10进行PCR鉴定得到1条带证实，大小正确。

图1 重组质粒pUCm-T-M 10双酶切鉴定电泳图谱Fig.1 Electrophoretogram is double enzyme digestion of pUCm-T-M 10.1:samples;2:pUCm-T;M:DL5 000 DNA marker.

图2 重组质粒pET-15b-M 10双酶切鉴定及PCR鉴定电泳图谱电泳图谱Fig.2 Electrophoretogram is double enzyme digestion and PCR of pET-15b-M 10.1:PCR of pET-15b-M 10;2: sample;3:pET-15b;M:DL5 000 DNA marker.

2.3 17β-hsd10的表达及纯化

重组工程菌株采用IPTG诱导，使其表达17β-hsd10蛋白，对诱导表达过程中的主要影响因素进行优化分析，纯化产物SDS-PAGE鉴定如图3，在约29.5 kDa处有一条明显表达带，与预期蛋白分子量相符。

2.4 双抗夹心ELISA方法的建立

本研究最终获得的兔源和鼠源抗17β-hsd10多克隆抗体效价分别为1.25×104和2.5×104。其中鼠源多克隆抗体的最佳包被浓度为2.5µg/m L，兔源多克隆抗体的最佳工作浓度为1.0µg/m L，酶标抗体的稀释倍数为1：5 000。方阵试验数据为对应反应条件下的S/N值(表3)。 17β-hsd10;3:E.coli BL21(pET-15b);4:E.coli BL21 (pET-15b-M 10).

图3 17β-hsd10蛋白诱导表达及纯化SDS-PAGE电泳图谱Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant 17β-hsd10 protein expression and purified protein.M:marker;1,2:

2.5 特异性实验

用本研究建立的方法对3α-hsd、11β-hsd、17β-hsd4、7的标准品进行检测，蛋氨酸-γ裂解酶(MGL)，M 10(+)为含有17β-hsd10和M 10(–)为不含有17β-hsd10。结果显示除重组蛋白显示阳性外，其他受试蛋白并未测出阳性，说明本方法的特异性较好(表4)。

2.6 敏感性实验

检测17β-hsd10(M 10+)阳性血清，OD450值随着稀释倍数的增加而减小(图4)，当血清12 800倍稀释时，检测结果为阳性，当血清25 600倍稀释时，检测结果为阴性，即所能检测的最小范围在0.1−0.05 μg/m L，所建立的方法具有较好的敏感性。

表3 鼠源抗17β-hsd10多抗及兔源抗17β-hsd10多抗的最佳工作浓度确定Tab le 3 Determ ination of the op timal concentration of coating antibody and rabbit-anti-17β-hsd10-IgG

表4 交叉反应实验Tab le 4 The ELISA specific test

图4 ELISA检测M 10阳性血清的最大稀释倍数和P/N值Fig.4 The dilution ratio of the positive serum sample by ELISA.Carry 3 groups,two parallel samples of each group,the above OD450data are average for each group.

3 讨论

本文克隆了与AD相关的17β-hsd10的基因，与已登记的小鼠17β-hsd10比对，未发现碱基突变；经BLAST比对发现，与人类的17β-hsd10的基因同源性为99%。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示，17β-hsd10在E.coli中获得了高纯度表达。采用该纯化蛋白作为抗原免疫动物，获得了高效价多克隆抗体，3α-hsd、11β-hsd、17β-hsd等其他类型的羟基类固醇脱氢酶呈阴性反应，说明该方法对于17β-hsd10具有良好的特异性；同时，实验结果显示，当血清中存在0.05µg/m L以上的17β-hsd10时，该方法仍然可以准确检出，说明本文建立的方法具有高度的敏感性。本文建立的17β-hsd10双抗夹心ELISA方法，通过进一步地改进提高与验证，为研制检测阿尔茨海黙病新方法奠定了基础。

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(本文责编 陈宏宇)

M olecular cloning,prokaryotic expression and double-antibody sandw ich ELISA developm ent of 17β-hsd10 in mouse

Chuanzhi Liu,Yingying Niu,Yuan’an Chen,Cheng W u,and Yuanhua Yu

School of Life Science and Technology,Changchun University of Science&Technology,Changchun 130022,Jilin,China

We expressed 17β-hydroxysteroid dehydrogenase10(17β-hsd10)recombinant protein,prepared anti-17βhsd10 polyclonal antibodies and established sandw ich enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)test for detection of 17β-hsd10.RT-PCR was used to get the gene of 17β-hsd10 of mouse liver,and a prokaryotic protein expression system pET15b-17β-hsd10/Escherichia coli BL21(DE3)which induced w ith isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside(IPTG)for recombinant protein expression was constructed subsequently.The target protein purified using His-Binding-resin column was used to immunize BALB/c m ice and rabbits,serum total IgGs from immunized animals were purified by ammonium sulfate precipitation method.We established a Double-antibody Sandw ich enzyme linked immunosorbent assay about 17β-hsd10 using the two antibodies we prepared.We got the concentration of 1.5 mg/m L of 17β-hsd10 protein w ith molecular weight of 29.5 kDa,and polyclonal antibodies from mouse and rabbit w ith the tite 1.25×104and 2.5×104respectively.The concentration of 0.1µg/m L of 17β-hsd10 can be detected by the Double-antibody Sandw ich ELISA we established,and the assay was sensitive and specific.It can be w idely used in clinical and experimental study.

17β-hydroxysteroid dehydrogenase10,double-antibody Sandw ich ELISA,polyclonal antibodies

January 26,2014;Accep ted:July 25,2014

Yuanhua Yu.Tel/Fax:+86-431-85583099;E-mail:yuyuanhua8888@126.com

刘传志,牛莹莹,陈元安,等.小鼠17β-hsd10的克隆、表达及双抗夹心ELISA方法的建立.生物工程学报，2014,30(11): 1774–1780.

Liu CZ,Niu YY,Chen YA,et al.Molecular cloning,prokaryotic expression and double-antibody sandw ich ELISA development of 17β-hsd10 in mouse.Chin J Biotech,2014,30(11):1774–1780.

Suppo rted by:Key Project in the Science and Technology Development Program of Jilin(No.20120963).

吉林省科技发展计划重点项目（No.20120963）资助。