血液总RNA提取方法的比较

孟 浩 彭 贞 王 闯 刘瑞兰 高庆华

RNA分子的提取是分子生物学研究中一项的基本内容，是进行基因表达分析的基础［1］。随着分子生物学技术的迅猛发展及在医学领域中的普及，以RNA为研究对象的分子生物学实验与日俱增。外周血作为常用的理想实验材料，由于取材方便，且不需组织匀浆等客观因素的影响，可用作分子印迹和病毒学研究的对象［2］，而被广泛应用。血液总RNA提取所采用的Trizol法常作为RNA提取的方法之一，这与Trizol试剂本身能有效的从细胞或组织中直接提取RNA，并且在实验中降低血液中含有的RNA酶污染，防止RNA酶对RNA的降解有关。这也正是保证所得RNA片段完整的关键。

大量的研究实验证明:虽然提取RNA的方法很多，但是其基本都是把细胞破碎以后，以除去材料中糖、蛋白质、DNA等杂质为目标。而且材料自身物理化学性质的不同，不同的材料需要不同的提取方法［3～5］。但在分离血液总RNA所采用的不同抗凝血液在实际运用的效果甚少。本文正是利用在不同抗凝血液和红细胞裂解前后的对比。从而，获得最佳质量总RNA和实用的提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料

羊外周静脉血，采自塔里木大学动物科学学院动物实验站，分别用ACD和肝素钠作为血液抗凝试剂。

1.2 试剂

DEPC水:1:1 000比例DEPC加入超纯水。常温下，磁力搅拌3～4 h，10～11 h静置孵育，121℃、30 min灭活。

ACD:柠檬酸 4.8 g、柠檬酸钠13.2 g、葡萄糖14.7 g定容于1 L的无酶水红细胞裂解液:氯化铵8.29 g、碳酸氢钾 1 g、EDTA 0.037 g定容于1 L 的无酶水Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无水乙醇、75%乙醇无酶水配置。

1.3 方法

1.3.1 经典Trizol法直接提取血液总RNA

取不同抗凝后的血样0.5 mL放置于无RNA酶离心管中，加3倍体积Trizol，震荡混匀，室温静置5 min;4℃，12 000 g/min，离心15 min。用移液器吸取上清，到另一无酶离心管，按照1 000μL Trizol体积加入200μL氯仿，涡旋15 s，静置3 min;4℃，12 000 g/min，离心15 min。取上清450μL至干净无酶1.5 mL离心管，按1000μL Trizol体积加入预冷的500μL异丙醇。混匀、室温静置10 min，4℃，12 000 g/min，离心15 min。小心吸弃上清，留管底沉淀，加入1 mL由DEPC水配置的75%乙醇，吹打混匀，4℃，8 000 g/min，离心5 min。弃上清，倒置于干净的滤纸片刻，开盖，挥发乙醇2～3 min，加入15μL DEPC水，吹打混匀，55℃ ～60℃水浴10 min，－70℃保存。

1.3.2 裂解法提取血液总RNA

1.3.2.1 裂解红细胞

取0.5 mL抗凝血液，按1:3体积加入预冷红细胞裂解液，混匀，室温静置10 min，4℃，10 000 r/min，离心1 min。小心弃去上清，保留管底细胞沉淀。

1.3.2.2 Trizol提取细胞总 RNA

向细胞沉淀的离心管中加入1.5 mL Trizol试剂，震荡混匀，静置5 min，再按照1 000μL Trizol体积加入200μL氯仿，其余处理方法与经典Trizol法处理相同。

1.3.3 总RNA完整性和浓度检测

取4μL总RNA与2μL 6×Loading Buffer混合后，点样于1%(含有0.05μg/mL EB)琼脂糖凝胶，150 V恒压电泳进行检测，15 min后在凝胶成像系统(美国，Bio－Rad公司)进行拍照检测。

使用Thermo公司的NanoDrop2000c进行260 nm和280 nm偏振光检测，估测RNA浓度和纯度比值。根据RNA浓度=40μg·mL－1×稀释倍数×Abs260nm计算出 RNA浓度。

2 结果与分析

2.1 总RNA样品的1%琼脂糖凝胶电泳

经过凝胶成像系统拍照检测。所得结果如下图:

图1 全血中直接提取RNA

图2 裂解红细胞后提取RNA

电泳结果显示，在肝素钠抗凝血液中，红细胞裂解处理前后提取的总RNA，均有三条明显亮带，说明提取过程中，未发生RNA的降解，完整性好。而在采用ACD抗凝处理后的血液总RNA未能出现预期的三条带型。

在肝素钠抗凝的血液经过裂解液处理后，总RNA带型清晰、明确。28S的亮度大于18S。全血直接提取总RNA结果，在凝胶检测时产生抹带、拖尾现象。

在ACD抗凝血液采用两种不同方法提取总RNA，经电泳检测之后，均出现条带不完整，且带型模糊现象。

2.2 总RNA浓度检测

使用Thermo公司的NanoDrop2000c进行260 nm和280 nm偏振光检测，计算机自行算出总RNA浓度和A260/A280比值，得到表1、表2结果:

表1 未经红细胞裂解处理总RNA浓度和纯度

表2 红细胞裂解处理后总RNA浓度和纯度

3 讨论

在RNA的提取过程中，由于RNA核糖残基带有羟基，导致RNA比DNA化学性质更活跃，易被RNA酶降解，这就要求提取RNA的步骤尽可能减小RNA酶污染［6］。在本实验中，RNA提取所用的仪器和枪头都采取灭酶处理，实验中勤换手套，杜绝由人为操作带入外源RNA酶的污染，最终得到本实验结果。在比较图中处理前与处理后之间的差异可以看出:在经过两种方法分别提取总RNA的时候，直接提取的效果不如裂解红细胞之后的效果。直接提取的总RNA出现相应程度抹带和带型不完整现象，这与淳俊等人［7］在用Trizol提取总RNA进行电泳检测出现的带型不完整现象相似。同时，28S的亮度也未出现大于18S亮度两倍的情况，这可能与过多的细胞含有的内源性RNA酶对RNA的降解产生有关［8］。利用分光光度计对总RNA进行浓度和A260/A280值检测中，发现两种提取结果A260/A280的比值都在1.8～2.0之间。证明两种方法提取总RNA纯度较好，提取结果里未出现有蛋白的污染［9］，但总RNA的浓度差别较大，直接提取总RNA的浓度明显小于通过裂解红细胞后的总RNA浓度。由此推断，血液中内源RNA酶是影响RNA提取产量至关重要的因素［10－11］。

另外，在对不同抗凝剂对总RNA提取的影响，我们也做了相关的研究。其中，在控制了电泳时间、凝胶孔径大小等因素后，对采用不同抗凝剂后的血样抽提RNA，在结果中我们发现:经过琼脂糖凝胶电泳，肝素钠抗凝的血液中，条带的亮度明显比ACD抗凝血液得到的条带要亮，并且带型清晰、完整。但经过分光光度计检测，浓度并无较大差别，这可能与谢胜松等［12］人所提出的利用琼脂糖检测RNA质量，其中稀释与否和上样量对RNA检测有关。同时我们在对抗凝剂可能对RNA提取质量影响的研究中发现，在利用不同的抗凝剂对RNA的溶解也可产生一定的影响。例如Sung Jae kim等人研究了在不同抗凝剂贮存血液方式下，对提取RNA的质量有明显的影响，在该研究中发现用柠檬酸钠抗凝的血液，经Trizol法提取后的RNA，在后期实验中可用来做cDNA的合成，而ACD含有的成分主要是柠檬酸钠;在肝素抗凝后的血液，在相同方法提取的RNA，可作为基因芯片的研究［13］。由此解释了在采用不同抗凝剂处理后的血液，对RNA的提取质量有明显的影响，尤其是对分子克隆、基因芯片等较高标准分子生物学研究中所提出的RNA完整性、纯度、浓度等要求。

4 结论

在以绵羊血液为试材，利用经典Trizol法对比两种不同抗凝剂和红细胞裂解前后处理外周血得到的总RNA效果，得出经肝素钠抗凝且红细胞裂解液处理后外周血液的总RNA质量和纯度最好，可作为分子生物学实验后期较高标准的研究基础。

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