高脂血症大鼠模型几种造模方法的筛选及优化

2014-06-17梁桂洪林勇凯黄宇新

动物医学进展 2014年10期

孙赫，梁桂洪，林勇凯，黄宇新

（广州中医药大学第三临床医学院，广东广州510405）

高脂血症，即血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）的增高以及高密度脂蛋白（HDL）的降低，是脂质代谢障碍的表现，也是动脉粥样硬化、心脑血管疾病、脂肪肝和中风的主要危害因素［1-3］。近年来，随着人们饮食结构和生活水平及模式的变化，高脂血症的发病率逐年升高，尤其是中老年人，高脂血症是脑卒中、冠心病、心肌梗死、心肌猝死等的危险因素，因此越来越引起医学界的关注。高脂血症机体调节血脂的能力和血管机能状态可以通过血清髓过氧化物酶（MPO）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量体现，后二者反映了机体脂质过氧化程度和清除自由基的能力。而脂质的过氧化易引发NO 生成减少，MPO 可降低NO 的生物活性，最终加剧了炎性反应，引起血管内皮细胞功能障碍等，发生动脉粥样硬化。研究高脂血症的关键是选择理想的高脂血症动物模型，本研究在查阅文献［4-8］的基础上，选取并改进了其中3种喂养造模法，观察不同时间大鼠血脂、血清超氧化物歧化酶、丙二醛、一氧化氮和髓过氧化物酶水平的变化，筛选及优化出省时、省力而且经济稳定的高脂血症大鼠模型的理想建立方法，以建立与人类高脂血症的发病机制相同或相近的高血脂动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物健康SPF 级雄性SD 大鼠40只，雄性，体重180g～220g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（粤）2013-0020。

1.1.2 造模材料食用油，广州市花都区花东信华实验动物养殖场产品；胆固醇、丙硫氧嘧啶和胆酸钠，上海蓝基生物科技有限公司产品，批号分别为100521，100510，100421；吐温80，广州威佳济恒科技有限公司产品，批号：103170。

1.1.2.1 高脂饲料配方基础饲料56.8%＋食用油15%＋蛋黄粉10%＋蔗糖10%＋胆固醇6%＋胆酸钠2%＋丙基硫氧嘧啶0.2%。

1.1.2.2 高脂乳剂配方吐温60%＋食用油15%＋胆固醇6%＋胆酸钠2%＋丙基硫氧嘧啶0.2%。具体制备方法为：①食用油在80℃水浴中搅拌加热；②于加热后的食用油中加入胆固醇和丙基硫氧嘧啶，充分搅拌溶解；③再加入胆盐和适量蒸馏水，充分搅拌使胆盐溶解；④再加适量吐温，充分搅拌直至产生乳化现象；⑤缓慢加入37 ℃的温水稀释至100mL，即可成为稳定的高脂乳剂。保存于-20 ℃冰箱中备用，大鼠灌胃前于80 ℃水浴中加热融化。

1.1.3 试剂氯化钠注射液9g／L，武汉市滨湖双鹤药业有限责任公司产品，批号：120120906；维生素D3注射液1mL∶7.5g／30万单位，哈尔滨市宏达动物药品厂产品，批号：080021417；TC、TG、LDLC、HDL-C 试剂盒，南京建成科技有限公司产品，批号分别为S10020062，S10030054，S10020071，S10030023；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒，丙二醛（MDA）试剂盒，一氧化氮（NO）试剂盒，髓过氧化物酶（MPO）试剂盒，南京建成生物工程研究所产品，批号：20130902，20130823，20130824，20130831。

1.1.4 仪器设备 BP121S型电子天平，美国塞多利公司产品；TGL-16M 型高速离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司产品；FYL-YS-128L 型-20 ℃冰箱，北京福意电器有限公司产品；Forma 88000 系列-86 ℃超低温冰箱，赛默飞世尔科技有限公司产品；UV-7504型单光束紫外可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司产品；Ultra Pure UF型和泰凯弗隆实验室纯水系统，上海和泰仪器有限公司产品；DG5033A 型酶标仪，南京华东电子集团医疗装备有限责任公司产品；FinnPiPette移液枪。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 40只大鼠在室温下23℃±2℃自由饮水，常规喂饲基础饲料1周后，随机分为空白组、模型组Ⅰ、模型组Ⅱ、模型组Ⅲ，每组10只。

1.2.2 动物模型的制备空白组大鼠给予基础饲料，每只进食量30g／d，分三餐定时定量给予，并按10mL／（kg·d）的容量生理盐水灌胃。各模型组分别采用不同造模方法诱导高脂血症大鼠模型，模型组Ⅰ：高脂饲料配方饲喂造模；模型组Ⅱ：基础饲料喂养配合高脂乳剂灌胃法，按10mL／（kg·d）的容量高脂乳剂给予大鼠，灌胃；模型组Ⅲ：造模前，一次性腹腔注射维生素D3600 000 U／kg后，造模方法同模型组Ⅱ。

1.2.3 样品制备及检测分别于造模1周、3周和5周，末次给高脂乳剂16h 后，用乙醚气体麻醉大鼠，用玻璃毛细管进行眦内静脉采血2 mL，全血样本室温放置1h，3 000r／min离心10min，取上清液为样品，采用ELISA 法分别检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和髓过氧化物酶（MPO）等指标的水平，检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。根据一系列标准品的浓度及对应的OD 450nm 值，通过CurveExpert1.3 软件分析并分别得到TC、TG、HDL-C、LDL-C、SOD、MDA、NO、MPO 的标准曲线图及其方程式，将样品OD 450值代入方程式，分别计算TC、TG、HDL-C、LDL-C、MDA、NO、MPO 的含量及SOD 活力。

1.2.4 大鼠肝指数计算方法大鼠肝指数＝［大鼠肝脏质量（g）／体质量（g）］×100%。

1.2.5 统计学处理采用SPSS 19.0统计学软件进行统计学处理。数据结果以±SD表示，多组间比较用单因素方差分析，采用LSD多重比较方法比较组间的变量差异，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模1周各组大鼠血脂指标

与空白组比较，模型组Ⅰ与模型组Ⅱ中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平差异不显著（P＞0.05）；模型组Ⅲ中TC、TG、LDL-C水平显著升高（P＜0.05），HDL-C水平差异不显著（P＞0.05）（表1）。

表1 造模1周各组大鼠的血脂指标Table 1 The levels of lipid parameters of the rats in each group at the end of 1week after modeling

2.2 造模3周各组大鼠血脂指标

与空白组比较，模型组Ⅰ中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平差异不显著（P＞0.05），模型组Ⅱ中TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平差异不显著（P＞0.05），模型组Ⅲ中TC、TG、LDL-C 水平显著升高，HDL-C水平显著降低（P＜0.05）。与模型组Ⅱ与比较，模型组Ⅲ中TC、TG、LDL-C 水平显著升高，HDL-C水平显著降低（P＜0.05）（表2）。

表2 造模3周各组大鼠的血脂指标Table 2 The levels of lipid parameters of the rats in each group at the end of 3weeks after modeling

2.3 造模5周各组大鼠血脂指标

与空白组比较，模型组Ⅰ中TC、TG、LDL-C 水平显著升高，HDL-C 水平差异不显著（P＞0.05），模型组Ⅱ、模型组Ⅲ中TC、TG、LDL-C 水平显著升高，HDL-C水平显著降低（P＜0.05）。与模型组Ⅱ比较，模型组Ⅲ中TC、TG、LDL-C 水平显著升高，HDL-C水平显著降低（P＜0.05）（表3）。

2.4 造模5周各组大鼠血清SOD活性、MPO、NO和MDA水平变化结果分析

与空白组比较，模型组Ⅰ中4项指标差异不显著（P＞0.05），模型组Ⅱ、模型组Ⅲ中MPO、NO、MDA 水平显著升高，SOD 活性显著降低（P＜0.05）。与模型组Ⅱ比较，模型组Ⅲ中MPO、NO、MDA 水平显著升高，SOD 活性显著降低（P＜0.05）（表4）。

2.5 各组大鼠的体重和肝指数变化

开始造模第2周后，与空白组对比，模型组Ⅱ、模型组Ⅲ中体重显著升高（P＜0.05）；第4周后，与空白组、模型组Ⅰ对比，模型组Ⅱ、模型组Ⅲ中体重显著升高（P＜0.05）；第6周后，与空白组对比，模型组Ⅰ、模型组Ⅱ和模型组Ⅲ中体重显著升高（P＜0.05），与模型组Ⅰ对比，模型组Ⅱ中体重无显著差异（P＞0.05）。与空白组对比，模型组Ⅱ、模型组Ⅲ中肝指数显著升高（P＜0.05）；与模型组Ⅰ对比，模型组Ⅱ中肝指数无显著差异（P＞0.05），模型组Ⅲ中肝指数显著升高（P＜0.05）（表5）。

表3 造模5周各组大鼠的血脂指标Table 3 The levels of lipid parameters of the rats in each group at the end of 5weeks after modeling

表4 各组大鼠血清SOD活性、MPO、NO、MDA含量水平Table 4 The levels of SOD，MPO，NO，MDA of the rats in each group

表5 各组大鼠的体重和肝指数Table 5 The levels of body weight and the liver index of the rats in each group

3 讨论

要建立合理且实用的高脂血症动物模型，在模型动物的选择上，需考虑造模动物脂质代谢、对膳食脂质调节、生理功能反应等应尽可能与人类相似，能较准确的反映人类高脂血症的各种变化，从而为人类高脂血症的预防、治疗提供思路。本次动物试验，在高脂饲料的配方中以市售食用油取代了猪油，试验结果证明，此配方同样可以建立高脂血症的动物模型，形成动物脂代谢紊乱。同时，食用油取代猪油的高脂血症动物模型，更接近目前人们的饮食状况。本试验通过检测TC、TG、HDL-C、LDL-C 的水平来衡量血脂变化情况［9-10］，为筛选理想的高脂血症大鼠模型提供依据，其4项血脂指标结果支持上述研究文献观点。

现代研究表明，高脂血症机体调节血脂的能力和动脉粥样硬化的发生、发展与血管内皮细胞的损伤和机体的脂质过氧化所造成的损伤有关，且血清过氧化脂质的含量与血清TC 呈正相关［9、11-12］。脂质的过氧化易引发NO 生成减少，导致其生物利用度降低，继而诱发氧化应激，损伤内皮细胞，加剧炎性反应［13-14］。另一方面，NO 生成减少，又造成内皮依赖性舒张功能调节失衡、血管张力增加、结构重建和内皮损伤［15］。而髓过氧化物酶（MPO）为血红素过氧化物酶超家族成员之一，是氧化应激的一个主要标志物，能通过调节NO 对血管信号传递和舒张的作用。其含量增多能直接改变血管的炎症反应性，进而引起血管内皮功能障碍［16］。故髓过氧化物酶（MPO）和NO 水平则反应血管内皮的功能状态。此外，SOD 是体内特异除超氧阴离子的一种抗氧化酶，调节体内的氧化和抗氧化的平衡［17］。高脂血症时会直接损伤动脉壁抗氧化机能，使动脉壁内超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，进而又使机体脂质代谢失调会产生大量的自由基，引发强烈的脂质过氧化作用，产生大量丙二醛（MDA），MDA 可反映机体内脂质过氧化的程度。综上可知SOD 和MDA之间呈现负相关的生物学特性［18-21］。两者反映机体脂质过氧化程度，间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度，清除自由基的能力［22］。上述四个指标不但从不同机制体现高脂血症机体调节血脂的能力和血管机能状态，又彼此相关、紧密联系。因此，试验可以通过检测血清SOD 活性和MDA、MPO 及NO 含量，在更深层次探讨建立与人类高脂血症的发病机制相同或相近的高血脂动物模型，筛选及优化出省时、省力而且经济稳定高脂血症大鼠模型的理想建立方法。

从大量的文献可知，形成高脂血症模型的配方很多，高脂饲料喂养或灌胃形成的实验动物模型应用最为常用。本实验室参照文献，将胆盐和丙硫氧嘧啶二者联合运用到高脂血症模型配方的效果较好［23-24］。有资料显示，若一次性注射超生理剂量维生素D3可致大鼠动脉出现弥漫性的中膜钙化，引起弹性纤维断裂，动脉僵硬、顺应性降低而发生动脉硬化，进而又加重高脂血症的程度，可防止因多种不确定因素导致动物模型不稳定的情况发生［25-26］。

本试验结果表明，高脂饮食方法造模（模型Ⅰ），在造模5 周还未能使SOD 活性、HDL-C、MDA 和MPO 含量有显著性差异，且这些高脂饲料脂肪含量高、不易储存、易氧化变质，且动物易出现"厌食"情况，故不易掌握每只大鼠每天高脂饲料的精确用量，且存在造模周期过长、费用过高或模型组血脂水平参差不齐等缺点，故对于研发新药的动物实验研究，此造模方法并不理想；而高脂乳剂灌胃，在2周时就可使各项指标差异均有显著性，但稳定性较差，SOD活性和MDA、MPO 和NO 含量虽有显著性差异，但对比在高脂乳剂灌胃的基础上超生理剂量维生素D3的造模方法，效果并不够理想。在高脂乳剂灌胃的基础上超生理剂量维生素D3的造模方法在1周时即可使TC、TG、LDL-C 均升高、且HDL 显著降低，体重、肝指数等各项指标在不同时期差异均有显著性，在造模5周后各项指标差异相比上述两种造模方法显著（P＞0.05）。对比上述方法，说明正常基础饲料喂养配合高脂乳剂灌胃法，按10mL／（kg·d）的容量高脂乳剂给大鼠灌胃（高脂乳剂配方：吐温60%＋食用油15%＋胆固醇6%＋胆酸钠2%＋丙基硫氧嘧啶0.2%），并在造模前，一次性腹腔注射维生素D3600 000U／kg，可以建立理想的高脂血症模型，且造模所需时间最短，3周左右即可，稳定性较高，随时间延长，血脂水平也不断升高，也最与人类高脂血症的发病机制相近。

本试验模型组Ⅲ在联合应用胆盐和丙硫氧嘧啶的基础上，制作高脂乳剂灌胃，通过注射超生理剂量维生素D3来加速动脉粥样硬化的进程，从而提高血脂浓度，加重血管内皮细胞损伤与脂质过氧化的程度，促进高脂血症大鼠模型的成功构建。综上所述，此方法快捷、稳定，适用于抗高胆固醇症新药、食品的研究与开发，是一个用于高脂血症研究较为理想的造模方法。

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