我国猪圆环病毒病2型疫苗及相关联苗的研究进展

王艳，李文平，韩乃瑞，郑明，3∗

（1.济南辽阔生物工程有限公司，济南250101；2.中国兽医药品监察所，北京100081；3.北京君智知识产权代理事务所，北京100081）

我国猪圆环病毒病2型疫苗及相关联苗的研究进展

王艳1，李文平2，韩乃瑞1，郑明2，3∗

（1.济南辽阔生物工程有限公司，济南250101；2.中国兽医药品监察所，北京100081；3.北京君智知识产权代理事务所，北京100081）

猪圆环病毒（PCV）能刺激机体产生中和性抗体，但该病毒体外增殖能力差，培养物病毒含量低，病毒接种细胞不产生病变等特性使传统的灭活疫苗、弱毒疫苗的生产受到了局限。通过对我国相关专利的分析，发现我国许多研究机构及学者在驯化和筛选适应PCV2生长的细胞系、构建重组病毒株、建立高密度培养技术等方面做了大量工作以期规避这些弊端，并开展了PCV2相关的二联苗、三联苗的研发工作，以有效预防PCV2及相关性疾病的发生。

猪圆环病毒；重组病毒株；高密度培养技术；联苗

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是圆环病毒属的代表种，是一种小而无囊膜、二十面体对称、单股环状DNA病毒，直径平均为17 nm，是目前兽医学上发现的最小的动物病毒，有PCV1和PCV2两个基因型，其中PCV2为致病性病毒，是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。除PMWS外，猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、增生性坏死性肺炎（PNP）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联，PCV2相关的猪病死亡率达10%～30%不等，较严重的猪场在暴发时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。

姜平等［1］采用PCV2上海分离株SH株，在PK－15细胞中大量增殖，经甲醛灭活加入白油佐剂进行乳化，制备常规的猪圆环病毒2型全病毒灭活疫苗。并证实PCV2病毒自身有很好的抗原性，使用猪圆环病毒2型疫苗免疫能够诱导免疫动物产生循环抗体和中和抗体，可抵抗PCV2病毒的攻击。该疫苗的生产、应用和普及为防止PCV2疾病的发生和流行提供了有力的工具。然而，在猪圆环病毒2型疫苗的研制过程中，发现该病毒体外增殖能力差，培养物病毒含量低，病毒接种细胞不产生病变，病毒含量不易测定，病毒感染动物临床反应不一，免疫力评价困难。本文主要通过对国内专利中PCV2疫苗申报情况进行综述分析，发现研究人员在驯化和筛选适应PCV2生长的细胞系、构建重组病毒株、建立高密度培养技术等方面做了大量工作以期规避这些弊端。

1 针对PCV2的载体表达系统的构建及亚单位疫苗的研制

Hamel等［2］通过对PCV基因组分析，发现PCV1和PCV2均可能含有11个开放阅读框（Openreading frame，ORF）。PCV2阅读框中，ORF1和ORF2为主要阅读框。现已证实ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，ORF2全长702 bp，编码病毒的主要结构蛋白及病毒核衣壳蛋白（Cap）。PCV2在细胞上的增殖滴度很低，应用传统的灭活疫苗和弱毒疫苗很难产生最佳的免疫效果；新型的疫苗如DNA疫苗，免疫效率不高。随着分子生物学技术的不断进步和外源蛋白表达系统的成功开发，利用病毒载体表达系统在细胞中大量表达重组PCV2 ORF2蛋白，研制出具有良好免疫效果的亚单位疫苗，对于PCV2相关病的防治具有重要的意义。

杆状病毒表达系统是目前比较成熟的表达系统之一，具有安全无毒、外源表达量高、可以对蛋白进行翻译后修饰等优点，已成功用于多种蛋白的生产和疫苗的制备。张许科等［3］利用杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中大量表达重组PCV2 ORF2蛋白，研制出具有良好免疫效果的亚单位疫苗，通过动物试验检测该亚单位疫苗免疫效果，其保护率在80%以上。包含多个抗原表位和中和抗原表位的Cap蛋白，已被公认为是PCV2主要的免疫保护性抗原，可以作为疫苗的候选蛋白。姜平等［4］将生长抑素（SS）与PCV2 Cap融合在杆状病毒系统中表达，开发了一种既可防控PCV2又能促进猪体生长的新型亚单位疫苗。SS是十四个氨基酸的小肽，与下丘脑生长激素释放因子（GHRF）共同调节生长激素（GH）的释放。通过小鼠免疫试验和猪体免疫保护试验证实了表达的重组蛋白能诱导产生针对PCV2的特异抗体，并可促进增重，使猪体产生针对PCV2攻毒的保护力。

范红结等［5］使用猪痘病毒载体构建表达PCV2Cap蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗，该疫苗兼具弱毒疫苗的免疫原性和灭活疫苗的安全性。因其在猪体内更易复制，不断表达Cap蛋白，使机体持续受到Cap的刺激，不断产生针对PCV2的中和抗体，能使猪体产生持久的保护力，相对用其他载体构建的疫苗具有更强的免疫特异性。可采用多种途径免疫目的动物，包括口服免疫，具有群体免疫优势，避免出现漏免的情况，使群体的抗体水平较一致，能够更好的抵抗外源病毒的攻击。

为了解决使用原核细胞和杆状病毒表达ORF2蛋白表达成本高，蛋白纯化困难等问题，张许科等［6］和文贤子［7］等利用毕赤酵母表达系统制备PCV2衣壳蛋白颗粒样疫苗。真核细胞表达获得的蛋白的活性和免疫原性要远远高于原核细胞表达的蛋白，并且可以形成病毒样颗粒，可以诱导高水平的免疫抗体，提供良好的保护力。前者选用了表达载体pPIC9K构建的基因工程菌，为Mut＋表型，具有完整的AOX1和AOX2基因。甲醇可严格调控和诱导AOX1基因的表达，AOX1基因表达水平的调控发生在转录水平，以甲醇为碳源生长的细胞能检测到AOX1基因的转录，而在其他碳源中生长的细胞则检测不到AOX1转录的信息，因此可用甲醇诱导毕赤酵母菌表达外源目的蛋白。研究中通过获得高拷贝的转化菌株来优化蛋白表达，并充分考虑毕赤酵母菌的密码子偏好性以及二级结构情况，进行目的基因高拷贝筛选，表达盒的拷贝数能够达到3个。通过这些措施，密码子改造后的ORF2的表达量可达到115 mg／L，相当于未改造前基因表达量的2倍，从而证实选用偏爱密码子对提高表达水平较为有效。使用甲醇诱导表达，以甲醇作为碳源，解决了其他原核细胞表达添加IPTG对动物存在毒性及高成本等问题。酵母菌在大量发酵培养条件下，培养物中毕赤酵母的细胞浓度与其分泌的目的蛋白的产量成正比，甲醇的添加量以刚好满足菌细胞生长所需的量，此时，外源基因的转录水平是过量甲醇诱导时的5倍以上。后者采用SUMO3为融合标签，可以增强Cap蛋白可溶性和提高Cap蛋白表达量，同时可以正确有效地切割目的蛋白与融合标签，保证表达Cap蛋白的不含任何多余的氨基酸；该酵母表达系统具有因子分泌信号肽，可使产物分泌出胞，有利于产品的纯化和生产。

2 建立高密度培养技术解决传统生产工艺的瓶颈问题

猪圆环病毒2型灭活疫苗的传统培养方式主要是转瓶培养细胞，进而增殖PCV2。但转瓶培养细胞增殖较为缓慢，而且生产过程中对细胞和病毒的培养条件难以监控，无法提供最佳的培养条件，造成该方法自动化程度低，劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致产品质量稳定性不够，批间差较大。同时提高病毒毒价，保证良好的临床效果也是解决猪圆环病毒2型灭活疫苗产业化的当务之急。近几年，随着兽用疫苗行业的发展，生物反应器作为一种新型工具，能有效提高病毒产量，减小疫苗批间差异，利用生物反应器替代传统的转瓶生产工艺已成为行业发展的趋势，在生产工艺优化与成本控制等方面均有很大的发展空间，成为最具前途的猪圆环病毒2型灭活疫苗生产技术之一。

吕蔚等［8］对制苗用细胞进行纯化筛选，提高其对病毒的敏感性。陈玉文等［9］在常规激流灌注式生物反应器培养系统中增加了一个灌注袋，使其细胞数量增加近一倍，提高了病毒液产量，病毒效价一般为107.3TCID50／mL左右；一次实验病毒总产量相当于200个10 L转瓶产量，详尽比较见表1。

表1 生物反应器与传统转瓶比较表

乔云龙等［10］采用抛弃型WAVE波浪生物反应器进行细胞培养，通过精密控制的摇动保证了培养体系的有效混合和传氧率。所加入微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养袋的摇动参数等对于猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力的高低等有非常显著的影响。在研究中对这些条件进行优化，最终所选用的微载体Cytodex－1在细胞培养袋中最适含量是3 g／L、细胞培养袋中微载体上细胞最佳接种量为3×105个／mL，并确定摆动角度8°、摆动速度为14 r／min能够最为显著的促进细胞的生长，最终有效提高猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产效率。

疫苗的免疫原性比较实验中，对采用WAVE波浪生物反应器制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗与采用转瓶制作的猪圆环病毒2型灭活疫苗进行比较。利用ELISA方法检测PCV2抗体，按统计学方法比较各组方差及OD均值差异显著性。数据显示：经转瓶生产的疫苗1次免疫21 d后，血清抗体阳性率从40.00%上升至79.31%，OD均值上升，但与免疫前差异不显著。第2次免疫21 d后，阳性率从79.31%上升至100%，OD均值进一步上升，且与二免前差异极显著。经生物反应器疫苗第1次免疫21 d后，阳性率从56.66%上升至100%，OD均值上升，与免疫前差异极显著。第2次免疫21 d后，阳性率仍是100%，OD均值继续上升，且与二免前差异极显著。由此表明，生物反应器制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫保护效果要明显优于转瓶制备的疫苗。

3 PCV2联合疫苗的开发

自20世纪90年代中期以来，由猪流感病毒作为原发性病原体引起的猪呼吸道疫病综合征给世界各国养猪业造成了严重的损失。当猪发生猪流感病毒和圆环病毒混合感染时，很容易把两者的混合感染当作PCV2单独感染治疗和预防，导致猪流感病毒病没有防治，造成猪的生长性能降低。张许科等［11］通过严谨的实验设计首次证实将PCV2抗原和猪流感病毒（SIV）抗原按照合适的比例联合使用，能产生保护性免疫应答，同时发现PCV2和SIV抗原有相互增强免疫效果的作用，并在后续试验中证实，当存在其中一种抗原时，另一种抗原量减半仍能维持本抗原的免疫效果。该猪圆环病毒病－猪流感病毒病二联灭活疫苗与猪圆环病毒病或猪流感病毒病单苗的效力相比，猪体免疫试验中，仅1次免疫就能够预防猪圆环病毒病和猪流感病毒病两种病原感染，降低了免疫成本，减少了免疫次数，猪体的应激反应小，有效避免多次免疫出现的不良反应。

PCV2感染可引起猪的免疫抑制，从而使机体更易感染其他病原，这也是PCV2与副猪嗜血杆菌、肺炎支原体等混合感染的重要原因。根据中国知识产权局专利局公开的资料显示，2011年至今，已有多家研究机构相继进行了猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗［12］；猪圆环病毒2型、肺炎支原体二联灭活疫苗［13－14］；猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗［15］；猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体三联灭活疫苗研究［16］，在研发过程中发现，降低某个抗原至原来量的1／2时，联苗的免疫保护效果比猪圆环病毒2型单苗的效果要好，而且抗原量减半后的联苗与抗原减半的猪圆环病毒2型单苗相比，效果明显更佳。证明了抗原组合物之间无相互干扰，甚至起到了协同作用，由于佐剂品种和量均相同，显然这种协同作用是由两种或几种抗原在一起引起的，并且由于抗原含量的减少使疫苗制备生产成本大大降低。

4 疫苗灭活剂及免疫效力评估方法

研究人员对猪圆环病毒2型灭活疫苗的灭活剂、灭活机制及灭活疫苗的免疫效力的评估展开了较为深入的研究：在对丙内酯（BPL）、N－乙酰乙烯亚胺（AEI）、二乙烯亚胺（BEI）等化学灭活剂进行比较、筛选较甲醛更优良的灭活剂方面取得了进展［17－19］，证实BPL、BEI都可以有效应用于PCV2病毒的灭活；随着分子生物学技术的不断发展，在猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫效力研究中，PCR、ELISA及IHC检测已应用于猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫效力的临床检测中，具有较高的灵敏性、特异性和可重复性，满足了检测精度的需要，保证了用实验动物检测猪圆环病毒2型灭活疫苗及其联苗免疫效力的结果更科学、可靠。

5 展望

随着我国研究工作者对PCV2认识的逐步深入，在提高培养物病毒含量、减少培养物批间差、保证良好的临床效果及利用生物反应器建立高密度培养技术方面取得了显著效果，但是，目前的生物反应器各自仍存在着一些弊端，需要加以改进：譬如，常规激流灌注式生物反应器培养系统存在着管道效应，导致灌注袋中培养的细胞状态不够均一，病毒增殖的整体状态不易把握等。另外，缺少逐级放大机制是限制常规激流灌注式生物反应器得到广泛使用的又一个因素。在波浪式生物反应器中不推荐多次使用微载体，因重复使用的微载体对细胞的粘附力较弱，最终导致产量降低，并且重复使用微载体的清洗过程的成本比使用新微载体的成本还高，限制了该生物反应器的广泛应用。

尽管对于构建重组载体表达PCV2－ORF抗原的工具和条件已趋于成熟，但是，该领域的研究目前仍面临一些问题亟待解决：猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗中多用原核和杆状病毒表达ORF2蛋白，但原核表达常以包涵体形式存在，涉及到变性、复性等操作繁琐步骤和成本高等不利因素，杆状病毒则有表达成本高，蛋白纯化困难等缺点。

［1］ 姜平，王先炜，李玉峰.猪圆环病毒2型灭活疫苗：中国，CN101240264A［P］.2008－08－13.

［2］ Hamel A L，Lin L L，Nayar G P.Nucleotide sequence of porcine circovirusassociatedwithpostweaningmultisystemicwasting syndrome in pigs［J］.J Virol，1998，72（6）：5262－5267.

［3］ 张许科，孙进忠，乔荣岑.猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法：中国，CN101884787 A［P］.2010－11－17.

［4］ 姜平，李文良，王先炜，等.融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素的重组杆状病毒及其亚单位疫苗：中国，CN 102363770 A［P］.2012－02－29.

［5］ 范红结，蔺辉星，陆承平.表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗及其制备方法：中国，CN 102824634 B［P］.2014－03－19.

［6］ 张许科，孙进忠，乔荣岑.酵母表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白与亚单位疫苗：中国，CN 102115755 A［P］.2011－07－06.

［7］ 文贤子，张志刚，杜恩岐.利用毕赤酵母表达系统生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白颗粒样疫苗的方法：中国，CN 103169961 A［P］.2013－06－26.

［8］ 吕蔚，徐倩倩，刘涛，等.一种制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法：中国，CN 103285385 A［P］.2013－09－11.

［9］ 陈玉文，朱鸿杰，郑敬敏，等.一种利用生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法：中国，CN 103100082 A［P］.2013－05－15.

［10］乔云龙，张娇娇，杨艳坤，等.利用WAVE波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法：中国，CN 103520715 A［P］.2014－01－22.

［11］张许科，孙进忠，白朝勇.含有猪圆环病毒2型抗原与猪流感抗原的疫苗组合物：中国，CN 103667196 A［P］.2014－03－26.

［12］张许科，孙进忠，白朝勇.含有猪圆环病毒2型抗原与副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物及其制备方法与应用：中国，CN 102988978 A［P］.2013－03－27.

［13］张许科，孙进忠，白朝勇.猪圆环病毒2型、肺炎支原体二联灭活疫苗及其制备方法：中国，CN 103127497 A［P］.2013－06－05.

［14］陈硕，王勇，王贵华.猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法：中国，CN 103263666 A［P］.2013－08－28.

［15］张许科，孙进忠，白朝勇.猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法：中国，CN 102961742 A［P］.2013－03－13.

［16］张许科，孙进忠，白朝勇.预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物及其制备方法：中国，CN 103083655 A［P］.2013－05－08.

［17］徐守振，尹燕博，王新.动物疫苗中常用抗原灭活剂的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2010，37（9）：162－167.

［18］卫龙兴，王福泉.动物疫苗中灭活剂与佐剂的种类及其作用［J］.现代农业科技，2009，19：321－322.

［19］叶蓉春，顾健.甲醛蒸汽灭菌技术应用及其研究进展［J］.中国消毒学杂志，2007，24（1）：70－72.

（编辑：侯向辉）

Research Progress of Porcine Circovirus Type 2 Vaccines and Porcine Circovirus Type 2 Combined Vaccines in China

WANG Yan1，LI Wen－ping2，HAN Nai－rui1，ZHENG Ming2，3∗
（1.Jinan Liaokuo Bio－Engineering Co Ltd，Jinan 250101，China；2.China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China；3.Beijing CHOICE＆CHANCE Intellectual Property Agency，Beijing 100081，China）

Porcine circovirus（PCV）can stimulate the body to produce antibodies against the virus.Preparation of traditional vaccines is limited by culture characteristics of PCV2，such as poor proliferative capacity of the virus in vitro，low virus content in the culture and the infected cells don’t show cytopathic effect（CPE），including traditional attenuated vaccines and inactivated vaccines.By analyzing related patents in our country we found that elaborate efforts were made to avoid these drawbacks by researchers from many institutions，including screening sensitive cell line，construction of recombinant virus strains and establishment of high density cultivation technology.The PCV2 combined vaccines have developed to prevent and control the outbreaks of PCV2 and some bacterial or viral diseases.

porcine circovirus；recombinant virus strains；high density cultivation technology；combined vaccine

2014－09－09

A

1002－1280（2014）11－0062－05

S858.28

王艳，硕士，从事兽用生物制品研发工作。

郑明。E－mail：13671072423＠139.com