一测多评法测定蓼博颗粒中4种有效成分的含量

游元，曾建国

（湖南农业大学，兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心，长沙410128）

一测多评法测定蓼博颗粒中4种有效成分的含量

游元，曾建国∗

（湖南农业大学，兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心，长沙410128）

建立中药复方制剂蓼博颗粒中4种有效成分一测多评的定量检测方法，以用于质量评价。以血根碱为内参物，建立白屈菜红碱、没食子酸与穿心莲内酯的相对校正因子，利用校正因子计算白屈菜红碱、没食子酸与穿心莲内酯的含量，实现一测多评；同时采用外标法测定以上4种成分的含量，比较两种方法的差异，验证一测多评法的准确性和科学性。蓼博颗粒中4种成分含量的计算值与实测值无显著差异。表明建立的只用1种对照品同时测定蓼博颗粒中4种有效成分的方法准确、可行，适合中药的多指标质量评价模式的要求。

高效液相色谱法；蓼博颗粒；一测多评；血根碱

蓼博颗粒复方是由辣蓼、穿心莲、博落回叶和鱼腥草四味中药材经提取浓缩而制成的颗粒剂，现代研究表明，蓼博颗粒制剂中含有的没食子酸、穿心莲内酯、血根碱和白屈菜红碱，具有抑菌［1－2］、抗炎［3］和抗细菌性腹泻［4］的功效。抗生素一直广泛用于治疗仔猪腹泻，目前抗生素的滥用以及其残留对人体产生的危害已经引起了人们的广泛关注［5－7］，蓼博颗粒临床上旨在替代抗生素用于预防和治疗断奶仔猪的腹泻。

本文主要通过一测多评法建立蓼博颗粒的质量标准。一测多评法是指利用中药有效成分内在函数关系和比例关系，只测定一个成分（对照品可得到者）实现多个成分（对照品难以得到或难供应）的同步测定。近年来关于一测多评的研究思路和方法在多种药材或饮片中多个成分的测定中得到了验证［8－10］。采用常规的外标法和内标法建立蓼博颗粒的质量标准需要4种对照品，有些对照品缺乏，即使有对照品，价格也昂贵，而采用一测多评法可以解决常规方法在复方质量标准研究中的不足。本文采用一测多评法以克服这一难题，即只使用一种对照品，通过引入相对校正因子，实现其它待测成分的测定，达到了用单一对照品对蓼博颗粒制剂多指标的质量控制的目的。对蓼博颗粒质量标准的建立提供了科学的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 1260 Series高效液相色谱仪，岛津LC20－30V高效液相色谱仪；AE240型电子天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）；KQ5200DE型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；冷冻离心机（HERMLE 2323K，德国）；DHG－9246A型电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。色谱柱：Welth Ultimate XB－C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），华普XCharge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和KromasilC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 药品与试剂 没食子酸对照品来源为中国食品药品检定研究院，批号110831－201204，含量为89.9%；穿心莲内酯对照品来源为中国食品药品检定研究院，批号110797－201108，含量为98.7%；盐酸血根碱和盐酸白屈菜红碱对照品由湖南美可达生物资源有限公司提供，批号分别是S20091001和100820，含量均大于98.0%；蓼博颗粒，批号：20130511、20130512、20130513、20130514、20130515、20140709、20140710、20140711、20140712和20140713，湖南美可达生物资源有限公司在研产品；水为Milli－Q超纯水；甲醇（色谱纯，Merck）；其他试剂均为分析纯。

1.3 高效液相色谱条件 采用Welth Ultimate XBC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.1%磷酸溶液（A）与甲醇（B），流速为0.8 mL／min，洗脱梯度为：0～10 min，12%B；10～11 min，12%～40%B；11～30 min，40%～70%B；30～40 min，70%～95%B；40～45 min，95%B；45～45.1 min，95%～12%B；45.1～50 min，12%B。柱温25℃，进样量5 μL。血根碱、白屈菜红碱的检测波长为274 nm，没食子酸和穿心莲内酯的检测波长为225 nm。

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照品溶液的制备 取没食子酸对照品约15 mg，穿心莲内酯对照品约5 mg，盐酸血根碱和盐酸白屈菜红碱对照品各约10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.15 mg／mL没食子酸、0.05 mg／mL穿心莲内酯和0.10 mg／mL血根碱与白屈菜红碱对照品储备液。精密量取上述对照品储备液2 mL，至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含没食子酸0.03 mg、穿心莲内酯0.01 mg、盐酸血根碱0.02 mg和盐酸白屈菜红碱0.02 mg的混合对照品溶液。

1.4.2 供试品溶液的制备 取蓼博颗粒样品1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－1.0%的盐酸溶液100 mL，密塞，称定重量，超声处理60 min，取出，放冷，称定重量，用甲醇－1.0%的盐酸溶液补足减失的重量，取上清液置10 mL离心管中，13500 r／min离心10 min，取上清液，用0.45 μm的滤膜过滤，即得。

2 结果

2.1 专属性考察 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，进样分析，结果见图1－图7。阴性对照在相应位置处未见色谱峰，方法专属性良好。

图1 对照品溶液（225 nm）的高效液相色谱图

图2 对照品溶液（274 nm）的高效液相色谱图

图3 供试品溶液（225 nm）的高效液相色谱图

图4 供试品溶液（274 nm）的高效液相色谱图

图5 缺博落回叶阴性样品（274 nm）的高效液相色谱图

图6 缺穿心莲阴性样品（225 nm）的高效液相色谱图

图7 缺辣蓼阴性样品（225 nm）的高效液相色谱图

2.2 线性关系考察 分别精密量取对照品储备液0.5、1、2、4、6和8 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件分析，分别以峰面积对进样浓度进行回归，求得回归方程，结果见表1。

表1 蓼博颗粒4种有效成分的线性关系和范围

2.3 相对校正因子计算 以血根碱为内参物，参照公式fkm＝fk／fm＝（Wk×Am）／（Wm×Ak）［11］，fkm为校正因子；式中Ak为内参物k的峰面积；Wk为内参物k的浓度；Am为待测组分m的峰面积；Wm为待测组分m的浓度。按“1.3”项下色谱条件，考察不同浓度对照品对fkm的影响。按“2.3”项下公式计算，结果见表2。

2.4 不同高效液相色谱仪与色谱柱上相对校正因子的考察 取“1.4.1”项下混合对照品溶液，按“1.3”项下色谱条件，“2.3”项下计算盐酸血根碱对盐酸白屈菜红碱、没食子酸和穿心莲内酯的校正因子。在Agilent1260 Series和岛津LC20－30V高效液相色谱仪系统上考察了不同品牌的3根色谱柱，见表3。

表2 血根碱对白屈菜红碱、没食子酸和穿心莲内酯的校正因子

表3 不同色谱仪及不同色谱柱的校正因子（n＝3）

2.5 待测组分色谱峰的定位 利用相对保留值（rk／s）定位，rk／s按下式计算：rk／s＝tR（k）／tR（s）（k为其它组分，s为内参物）。再根据峰形判断，即能够准确确定目标峰的准确位置，结果见表4。由表4可知，RSD＜5%，表明利用rk／s进行色谱峰定位是可行的。

2.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液5 μL，按上述色谱条件连续进样6次，记录没食子酸、穿心莲内酯、盐酸血根碱和盐酸白屈菜红碱的峰面积，峰面积的RSD分别为0.20%、0.12%、0.18%和0.17%，表明在此方法下仪器精密度符合要求。

2.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液5 μL，分别于配制后的0、2、4、6、12、24、48 h测定，没食子酸、穿心莲内酯、盐酸血根碱和盐酸白屈菜红碱峰面积的RSD分别为0.19%、0.28%、0.34%和0.23%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验 取批号为20130513的样品，按“1.4.2”项下方法制备供试品溶液6份，分别测定没食子酸、穿心莲内酯、血根碱和白屈菜红碱的含量，测得含量的RSD分别为0.23%、0.29%、0.17%和0.56%，表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的蓼博颗粒样品（批号：20130513），每份1 g，置200 mL的量瓶中，分别精密加入80%、100%、120%含量的没食子酸、穿心莲内酯、盐酸血根碱和盐酸白屈菜红碱对照品，混合均匀，作为添加样品，按“1.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.3”项下色谱条件测定，计算加样回收率，没食子酸、穿心莲内酯、血根碱和白屈菜红碱的回收率分别为99.46%、98.02%、99.27%和97.85%，RSD依次为1.03%、1.29%、1.37%和0.97%。

2.10 一测多评法与外标法测定结果比较 分别精密吸取不同批次样品供试品溶液各5 μL注入高效液相色谱仪，记录血根碱、白屈菜红碱、没食子酸和穿心莲内酯的峰面积，采用外标法和一测多评法计算其含量，结果见表5。统计分析采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，对外标法与一测多评法得到的蓼博颗粒中血根碱、白屈菜红碱、没食子酸和穿心莲内酯含量进行比较，结果（P＞0.05）表明两种方法测得的含量没有显著性差异。

表5 不同方法对蓼博颗粒中4中有效成分含量测定结果（n＝3）mg／g

3 讨论与小结

3.1 样品前处理方法的选择 本文对不同的提取方式、提取溶剂和提取时间进行了考察。结果表明，在提取时间和提取溶剂相同的条件下超声法与回流法的提取效果没有显著性差异；分别采用10%盐酸溶液和1%盐酸甲醇溶液作为提取溶剂，结果表明，没食子酸在两种溶剂的提取效率没有差异，在提取血根碱、白屈菜红碱和穿心莲内酯时后者的提取效率远大于前者；分别对30、60、150 min的提取时间进行考察，结果表明，提取时间60 min与30 min有显著性差异，而与提取150 min没有显著性差异。试验最终确定了“1.4.2”项下的方法。

3.2 检测波长的选择 文献报道没食子酸和穿心莲内酯在200～250 nm波长处有较大吸收，参照紫外可见分光光度法，在200～400 nm的波长范围进行扫描，结果显示没食子酸在225 nm处有最大吸收，穿心莲内酯在232 nm处有最大吸收。本实验综合考虑选择225 nm作为没食子酸和穿心莲内酯的检测波长。同样的方法得到274 nm作为血根碱与白屈菜红碱的检测波长。且在一测多评法中采用每种成分的最大吸收波长可以提高在不同仪器下的重复性。

3.3 内参物的选择 本试验以血根碱为内参物，盐酸血根碱为醇溶性化合物，其盐的稳定性强，试验中发现其对照品溶液放置较长时间后峰面积没有变化，在制剂中的含量也较高，因此选择血根碱为内参物对制剂中的4种成分进行测定，体现了一测多评的优势。

3.4 一测多评法色谱峰的定位 复方制剂中HPLC图谱的色谱峰较多，一测多评法中一个关键问题是如何准确定位色谱峰的位置。目前主要有三个方法：1、色谱法；2、光谱法；3、光谱法与色谱法相结合。试验中通过使用待测成分的最大吸收波长，提高了分析方法的灵敏度和各色谱峰的丰度，且由于目标峰位置的杂峰干扰较少，再结合色谱法的相对时间保留值可以判断出目标峰的准确位置。

本试验采用一测多评法同时对蓼博颗粒的四种有效成分进行了含量检测。试验结果表明，采用一测多评法计算的含量结果与外标法测得的含量结果没有显著性差异，可以在缺少白屈菜红碱、没食子酸和穿心莲内酯对照品的情况下，通过校正因子与色谱峰定位计算其含量，以实现对蓼博颗粒4种成分的质量控制，并对含有以上成分的其它产品的含量测定具有一定的参考价值。

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（编辑：陈希）

Determination of Four Kinds of Effective Components in Compound Liaobo Powder by Multi－component with a Single Maker

YOU Yuan，ZENG Jian－guo∗
（Hunan Agricultural University，National and Local Union Engineering Research Center for the Veterinary Herbal Medicine Resources and Initiative，Changsha 410128，China）

To establish a quantitative analysis method of multi－component by a single maker（QAMS）for the four components quantitative detection in Liaobo powder for its quantitative evaluation.Sanguinarine was used as the reference，the calibration factor of gallic acid，andrographolide and chelerythrine to that of sanguinarine were calculated respectively to get each relative calibration factor and the contents of active constituents were calculated by the relative calibration，and then，the method was set up.At the same time，external standard method was used to detect the contents of the four constituents，the two methods were compared to validate the accuracy and feasibility of the new method.No significate difference were found in the quantitative results of the four active constituents between the measured value and the calculated value.In this study，only one reference substance was used to determination of four effective ingredients in Liaobo powder at the same time.The method is accurate and feasible and suitable for the requirements of the multi－index evaluation model of Chinese traditional medicine.

HPLC；compound Liaobo powder；QAMS；sanguinarine

2014－09－05

A

1002－1280（2014）11－0037－06

S853.73

国家科技支撑计划（2011BAD34B02）

游元，硕士研究生，从事功能产品开发与评价。

曾建国。E－mail：ginkgo＠world－way.net