固相萃取-高效液相色谱法测定复合薯片中丙烯酰胺＊

蔡 文，谭兴和1，* ，张 喻1，，王 锋1，，张春艳1，，邓洁红1，

(1.湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128;2.柑桔资源综合利用国家地方联合工程实验室，湖南 长沙 410128)

油炸薯片是深受大众喜爱的休闲食品之一，但是该淀粉类食品在高温加工条件下容易产生丙烯酰胺，薯片因含水率低使其产生的丙烯酰胺远远高于其它高温油炸产品［1，2］。丙烯酰胺是世界公认的有毒有害物质，具有致癌性、神经毒性、基因毒性、遗传毒性［3-6］。过量摄入含有丙烯酰胺的食品，可能会对人们的健康造成威胁［7］。因此，减少或抑制食品中丙烯酰胺的生成是食品安全领域的重要课题。目前丙烯酰胺的检测分析方法应用较多的主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)［8，9］。利用 GC-MS 检测丙烯酰胺，需要对分析物进行衍生化处理，操作复杂，相对费时。LC-MS/MS法虽然无需衍生化处理，但是科研投入较大，不利于在实验室普及。薯片中的丙烯酰胺含量容易超标，具有研究代表性。目前关于高效液相色谱法测定丙烯酰胺含量的研究中，专门针对油炸复合薯片进行系统研究的不多。复合薯片基质复杂，提取液去油脂、蛋白质等前处理后进样分析，色谱图中丙烯酰胺峰受杂峰影响大，导致目标峰峰形不好或难以与杂峰分离，需要进一步净化处理。因此，本研究旨在通过固相萃取小柱与高效液相色谱联用，采用二极管阵列检测器测定复合薯片中的丙烯酰胺含量，建立一种经济、稳定可靠、成本较低的丙烯酰胺高效液相色谱分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Waters e2695型高效液相色谱仪、Waters 2995光电二极管阵列检测器、Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent TC-C18高效 Reliance保护柱(4.6 mm × 12.5 mm，5 μm)、Agilent TC-C18柱芯、密理博明澈-D24UV超纯水机、赛多利斯BS224S型电子天平、Eppendorf 5804 R台式冷冻离心机、SKY-200B型苏坤气浴摇床、友田YZ-1531-B 1.5L控温油炸锅、压片机、Eppendorf移液枪(0-100 μL、100-1000 μL、1000-5000 μL)、Waters Oasis HLB 固相萃取小柱(200 mg/6cc)、希波氏 0.45 μm 尼龙针筒过滤器。

1.2 材料与试剂

大西洋马铃薯:采自湖南农业大学园艺园林学院实验基地。

棕榈油:产自中储粮油脂工业东莞有限公司，购自湖南长沙市高桥大市场。

丙烯酰胺标准品(色谱级，浓度为1000 mg/L，体积为1 mL，购自 AccuStandard公司)、甲酸(色谱纯)、甲醇(色谱级)、正己烷(分析纯)、亚铁氰化钾(分析纯)、硫酸锌(分析纯)、试验用水均为超纯水。

1.3 方法

1.3.1 油炸复合薯片的制作工艺及操作要点［10］

新鲜马铃薯→清洗→机械去皮→蒸熟(100℃，15 min)→切片(厚度约3.0 mm)→隧道干燥箱干燥(60℃，10 h)→粉碎→过筛(80目)→配料→加水(40%，以马铃薯颗粒全粉质量计)→和粉→压片(厚度为1 mm)→切片(直径为5.0 cm)→油炸至金黄色(170℃，50 s)→出锅→沥油→研磨待测。

1.3.2 丙烯酰胺标准溶液的配制 将浓度为1000 mg/L丙烯酰胺标准溶液配制成2 mg/L的标准贮备液，置于棕色瓶中，贮藏在冰箱中冷藏备用。用该贮备液配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L 五个不同浓度的丙烯酰胺标准溶液。

1.3.3 样品前处理［11，12］准确称取 5.0000 g 粉碎均匀的复合薯片样品于50 mL的锥形瓶中，加入一定体积的提取溶剂和蛋白质沉淀剂，漩涡震荡20 min后在低温冷冻离心机上以10000 r/min离心20 min，过滤除去油层取滤液约5 mL至分液漏斗中，用正己烷以1∶1萃取两次。将水相液过0.45 μm微孔滤膜，再取2 mL滤液过经预先处理的固相萃取小柱(预处理是先用3 mL甲醇通过小柱，然后让3 mL超纯水通过小柱)，待样液全部通过小柱后用洗脱液洗脱，弃去最初0.5 mL流出液后收集滤液用于液相分析。

式中，X为样品中丙烯酰胺的含量(mg/kg);C为对应标准曲线中丙烯酰胺的含量(mg/L);V为样品提取液的总体积(mL);M为样品的质量(g)。

2 结果与分析

2.1 丙烯酰胺测定条件的确定

将丙烯酰胺标准溶液在190-210 nm波长范围进样分析，发现在190-200 nm之间目标峰的峰面积随波长的增加逐渐增大，然后逐渐减小。综合考虑流动相各成分的截止吸收波长，确定检测波长为210 nm。分别以不同的流动相比例、流速、柱温、进样量分析丙烯酰胺标准溶液和样品溶液，综合各色谱曲线中目标峰的峰形、保留时间等因素，最终选定流动相为甲醇/水(5∶95;V/V)、流速为 0.6 mL/min、柱温为30℃、进样量为10 μL。在此条件下，色谱峰峰形良好，保留时间合理。丙烯酰胺标准溶液色谱峰图如图1所示。

图1 丙烯酰胺标准液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of acrylamide standards

2.2 丙烯酰胺标准曲线的建立及检测限

在最佳色谱检测条件下将系列标准溶液进样，以色谱峰的峰面积为纵坐标，以对应的丙烯酰胺浓度为横坐标进行线性回归分析，得线性回归方程:Y=9.90 × 104X-1.57 ×103，相关系数为 0.9993，在0.2～1.0 mg/L范围内线性关系良好。再将丙烯酰胺标准溶液分别稀释至一定程度进样分析，结果显示浓度为0.01 mg/L时仪器能较好地检出，由此可知该仪器及检测方法的最低检测限小于10 ng/mL，该检测限范围及线性关系能够满足本试验的分析要求。

2.3 净化条件的优化

试验中比较了不经固相萃取小柱处理和经过处理的样品液进样分析后的色谱图，结果发现经固相萃取小柱净化处理的色谱图中杂峰较少，峰的分离度大大提高。参考相关文献［13，14］，选取 Oasis HLB固相萃取小柱对样品液进行净化处理。

图2 丙烯酰胺在HLB柱上的水洗脱曲线Fig.2 Elution curve of acrylamide by water on HLB cartridge

试验中采用不同比例的甲醇/水溶液作为洗脱剂，色谱数据显示纯水洗脱时，洗脱液中的杂质更少，丙烯酰胺回收率更高。图2是1.0 mg/L的丙烯酰胺标准溶液在HLB柱上的洗脱曲线。由图可见，上样流出液中完全检测不出丙烯酰胺，说明丙烯酰胺在HLB柱上有较好地保留。丙烯酰胺完全被洗脱需要约3 mL水。误差分析显示HLB柱用于样品净化处理稳定性好，重现性高，平均回收率达99.43%。样品的洗脱曲线显示，极性杂质主要集中在最初的0.5 mL洗脱液中。因此，实际操作中，弃去最初0.5 mL流出液后收集滤液用于液相分析。样品液色谱峰图如图3所示，可见目标峰峰形良好，丙烯酰胺峰与其它杂峰能够很好地分离。

2.4 精密度试验

将一定浓度的丙烯酰胺标准溶液进样分析，连续测定6次。结果见表1。6次进样峰面积平均值为96402微伏*秒，相对标准偏差(RSD)为1.19%，说明该仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

将样品液置于室温，分别在 0、1、2、3、4、5、6h 时进样检测，丙烯酰胺色谱峰的峰面积结果见表2。7次进样峰面积平均值为13743微伏*秒，相对标准偏差(RSD)为1.32%，说明该复合薯片样品溶液在6 h内比较稳定，利于实验室中的批量处理。

表1 精密度试验测定结果Tab.1 Results of precision experiment

图3 样品液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of sample

表2 稳定性试验测定结果Tab.2 Results of stability experiment

2.6 重现性试验

精密称取6份样品，按1.2.3进行样品前处理后进样检测，测定各丙烯酰胺的含量，结果见表3。5次进样丙烯酰胺含量平均值为0.9171 mg/kg，相对标准偏差(RSD)为1.69%，说明该方法重现性良好。

表3 重现性结果Tab.3 Results of reproducibility experiment

2.7 回收率试验

取自制油炸复合薯片样品，加入三个不同浓度的丙烯酰胺标准品进行加标回收率试验，每个样品平行测定三次，计算加标回收率，结果见表4。由表可见加标回收率在80%以上。

表4 加标回收率试验结果(n=3)Tab.4 Results of spiked recovery experiment(n=3)

3 结论

本文采用固相萃取-高效液相色谱法测定油炸复合薯片中的丙烯酰胺，样品在0.1%的甲酸水溶液中提取，采用Waters Oasis HLB固相萃取小柱对提取液净化处理，能较好地去除杂质的干扰。样品液在流动相为甲醇/水(5∶95;V∶V)，流速为 0.6 mL/min，检测波长为210 nm的条件下，丙烯酰胺能够在Agilent C18反相色谱柱中得到很好地保留和分离。该方法操作简便，精密度高，稳定性好，加标回收率较高，符合痕量分析的要求，能够很好地应用于复合薯片中丙烯酰胺的相关研究，以便控制食品中丙烯酰胺含量，减少丙烯酰胺对健康的危害。

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