家蚕墨蝶呤还原酶基因的体外表达及酶活性研究＊

李闻天，龚美霞，戴伟宏，张 蕾，王文静，刘朝良，孟 艳

(安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036)

家蚕(Bombyx mori)基因组框架图、精细图以及各种数据库的相继建立和不断完善，为发掘和鉴定家蚕基因、研究基因的生物学功能及应用前景奠定了良好的信息平台基础［1-3］。lemon(lem)是一种典型的黄体色家蚕突变体，其幼虫体表富含墨蝶呤(sepiapterin，SP)［4］。SP属于喋啶类化合物，是 GTP 分解代谢途径的中间产物。在高等动物中，SP是补救途径合成四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)的前体，经墨蝶呤还原酶(sepiapterin reductase，SPR)和二氢叶酸还原酶(dihydrobiopterin reductase，DHFR)催化完成(图 1)［5，6］。

SPR是以NADPH为辅酶催化蝶啶衍生物代谢的醛酮还原酶［7］，由GTP分解到BH4生成的从头合成途径中，SPR是催化最后一步反应的必需酶［7］，对于生物体合成BH4具有非常重要的生理功能。BH4是芳香族氨基酸羟化酶的必需辅酶，也是一氧化氮合酶的重要辅助因子。BH4的合成不足会导致神经递质的缺乏以及细胞内皮功能障碍，引发多种神经性生理代谢疾病［8-10］。

图1 四氢生物蝶呤的补救合成途径Fig.1 Salvage pathway of tetrahydrobiopteri synthesis.BH2，dihydrobiopterin，DHFR，dihyrofolate reductase

我们的前期研究表明，家蚕SPR(BmSPR，Gen-Bank登录号:AB465548)基因(BmSpr)的全长ORF为801 bp。与哺乳动物 SPR类似，BmSPR是家蚕体内合成BH4的重要酶之一，其活性的严重缺乏会导致幼虫因BH4的合成不足而死亡［11］。家蚕lem突变体是提取和纯化获得天然 SP的重要遗传资源。为了将从lem中大量提纯的SP应用于BH4的体外生物合成研究，本文对重组质粒pET-24b-BmSpr的原核表达系统进行了优化，得到了稳定表达BmSPR融合蛋白的实验条件，并对纯化获得的重组蛋白进行了酶学鉴定及活性分析。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂

重组质粒6×His pET-24b-BmSpr由本实验室前期构建;E.coli感受态细胞 Rosetta(DE3)和BL21(DE3)购自北京全式金公司;PCR扩增相关试剂购自TaKaRa公司;Anti-His Antibody、羊抗鼠 IgG-HRP、HRP-DAB底物显色试剂盒为 Tiangen公司产品;蛋白纯化、蛋白定量试剂盒分别为 QIAGEN公司和上海生工生物工程有限公司产品;PD-10蛋白脱盐柱购自GE公司;Immobilon-P PVDF膜为Millipore公司产品;SP标准品及 NADPH购自 Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 菌落 PCR

1.2.1 检测阳性克隆的引物序列

正向引物:M13F，5＇-GTTTTCCCAGTCACGAC-3＇;

反向引物:M13R，5＇-CAGGAAACAGCTATGAC-3＇。

1.2.2 PCR反应体系 25 μL反应体系中含10×扩增缓冲液 2.5 μL，0.3 U Tag 酶和 0.2 ～0.5 μg 模板 DNA，dNTP Mix、正反向引物的终浓度分别为0.8 mmol/L、0.4 μmol/L 和 0.4 μmol/L，最后用 ddH2O补齐。

1.2.3 PCR反应参数的设定 95℃预变性10 min，反应25个循环，每个循环包括94℃变性55 s，54℃退火58 s，72℃延伸1 min。循环结束后72℃延伸10 min，反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测确认。

1.3 优化重组蛋白表达条件

运用热击法将pET-24b-BmSpr重组质粒分别转化到BL21(DE3)及Rosetta(DE3)菌株感受态细胞，37℃，150 r/min活化一个小时后，将100 μL菌液均匀涂布于 LB 平板(含15 μg/mL Kanamycin)，37℃培养过夜。挑取经菌落PCR鉴定的阳性克隆，接种到含Kanamycin的LB液体培养基中，37℃，180 r/min震荡培养至 OD600≈0.5时，加入 1.0 mmol/L 的IPTG诱导重组蛋白的表达，对照组不加 IPTG。诱导4 h后，收集菌体，超声波破碎，离心，分别收集上清和细胞沉淀，进行SDS-PAGE检测［12］，分析不同菌株中重组BmSPR蛋白的表达情况。

以1.0 mmol/L的 IPTG诱导浓度，对照组不加IPTG，分别使用4℃、16℃、28℃和37℃诱导培养4 h后，收集菌体总蛋白进行SDS-PAGE检测，分析不同诱导温度下重组BmSPR蛋白在Rosetta(DE3)宿主菌中的表达情况。使用不同浓度梯度的 IPTG(0.2、0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2 、1.5 和 2.0 mmol/L)和不同诱导培养时间(0、1、2、3、4、5 和 6 h)，于37℃诱导重组蛋白在Rosetta(DE3)中的表达。收集菌体总蛋白进行 SDS-PAGE检测，分析重组蛋白在不同诱导条件下的表达情况。

1.4 大量诱导表达融合蛋白

在37℃培养条件下，用250 mL的LB液体培养基培养含重组质粒pET-24b-BmSpr的E.coli Rosetta(DE3)的阳性菌株，用 0.4 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白的表达，最后破碎细胞收集上清液，进行 SDSPAGE检测。

1.5 蛋白纯化及免疫印迹检测

扩大培养后，4℃ 8000 r/min离心10 min收集E.coli细胞，超声破碎，并收集细胞破碎上清液。参照说明书，用Ni-NTA亲和层析柱(QIAGEN)对重组蛋白进行纯化。经10%SDS-PAGE电泳检测确认后，将凝胶上的蛋白转至PVDF膜上，以His-Tag单克隆抗体(Tiangen)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP抗体(Tiangen)为二抗，进行Western blot分析，然后参照HRP-DAB显色试剂盒 (Tiangen)说明书进行显色反应［13］

1.6 酶活特性分析

使用BCA法试剂盒(上海生工)对纯化后的蛋白进行定量，并参照Katoh［14］的方法，进行SPR酶活性分析。反应体系为0.1 mL(含100 mmol/L磷酸钾缓冲液 pH 6.4，SP 50 μmol/L，NADPH 100 μmol/L)，加入0.2 μg重组酶蛋白，37℃反应 10 min后，在420 nm处测定底物SP的OD值变化。对照组则不加重组蛋白。根据反应前后SP吸光值的变化和标准曲线计算酶活单位。酶活力单位定义为:每分钟还原1 nmol SP所需的酶量 (nmol/min·μg-1)。设定不同梯度的温度(20-90℃)和反应液 pH(20 mmol/L Britton-Robinson buffer，pH 2.0-12.0)，检测不同温度及pH对酶活性的影响，探究重组蛋白的最适反应条件。

2 结果与分析

2.1 BmSPR体外表达条件的优化

筛选转化成功的重组质粒阳性克隆，经菌落PCR排除假阳性，并经测序(上海生工)确认序列准确无误，用IPTG(1.0 mmol/L)诱导重组子在不同宿主细胞的表达。菌落PCR结果如图2所示，PCR产物大小约为800 bp，与预期相符。SDS-PAGE结果显示，经IPTG诱导后，在E.coli菌株 Rosetta(DE3)及BL21(DE3)的细胞破碎上清液中均出现大小约为30 kDa的特异性条带，与目的蛋白的预测分子量相符，且两菌株之间的表达量没有明显差异 (图3)，在细胞沉淀中目的蛋白的表达量相对较少(数据未附)。

图2 阳性克隆的菌落PCR鉴定Fig.2 Identification of pET-24b-BmSpr positive transformants by colony PCR

以Rosetta(DE3)为宿主菌，使用1.0 mmol/L的IPTG诱导，分别以4℃、16℃、28℃和37℃诱导表达4 h，分析重组蛋白在不同诱导温度条件下的表达情况。结果如图4所示，无 IPTG诱导时，SDS-PAGE未检测到目的蛋白的表达，37℃诱导条件下目的蛋白的表达量明显高于其他诱导温度。

以Rosetta(DE3)为宿主菌，在37℃的培养条件下，通过改变IPTG浓度 (0.2-2.0 mmol/L)及培养时间(1-6 h)，分析重组蛋白在不同诱导培养条件下的表达情况。结果如图5所示，无IPTG诱导时，SDS-PAGE未检测到目的蛋白的表达，而不同IPTG诱导浓度(图5A)之间及不同诱导时间(图5B)之间对目的蛋白的表达量几乎没有影响，表明重组蛋白在该表达系统能够稳定表达。

图3 重组BmSPR在不同E.coli菌株中的表达情况Fig.3 Expression of recombinant BmSPR in different E.coli strains

图4 不同诱导温度下重组BmSPR表达量的SDSPAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant protein at different inducing temperature

图5 不同浓度IPTG(A)及不同培养时间(B)对重组BmSPR诱导表达的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the induced expression of recombinant BmSPR by different concentrations of IPTG(A)and different incubation time(B)

2.2 BmSPR蛋白的纯化及 Western blot检测

根据上述表达条件的优化结果，以E.coli Rosetta(DE3)菌株为宿主菌，用 0.4 mmol/L IPTG大量诱导BmSPR的体外表达，培养3 h后破碎细胞，收集上清液蛋白，SDS-PAGE确认了重组蛋白的表达(图 6A)。

用Ni-NTA亲和层析柱对重组BmSPR蛋白进行纯化，SDS-PAGE检测得到符合预期分子量大小的单一条带，初步说明重组蛋白纯化效果较佳 (图6B)。Western blot检测发现，经IPTG诱导且纯化过的蛋白得到特异性条带，而对照组(未经诱导)没有检出信号，再次证明了所表达和纯化的蛋白为目的重组蛋白 BmSPR(图6C)。

图6 重组BmSPR的表达(A)、纯化(B)与鉴定(C)Fig.6 SDS-PAGE analysis of the expression(A)and purification(B)and western blot analysis of the identification(C)of recombinant BmSPR

2.3 BmSPR的酶活性分析

如图7A所示，BmSPR在40-70℃的温度范围内，保持较高的活性，50℃为最适反应温度。为分析pH对BmSPR活性的影响，使用终浓度为50 mmol/L不同 pH(2.0-12.0)的 Britton-Robinson buffer，酶蛋白加入各反应体系，于37℃反应10 min后计算酶活性。如图7B所示，BmSPR在 pH 4-6之间表现出较高的酶活性，pH 5为最适pH值。

图7 不同反应温度(A)和pH(B)对BmSPR酶活性的影响Fig.7 Relative enzymatic activities of BmSPR at different reaction temperatures(A)and pH values(B)

3 讨论

本实验用 E.coli不同菌株 (图3)，通过改变诱导温度、IPTG诱导浓度和诱导时间对家蚕SPR的体外表达条件进行了优化 (图4，图5)，最终选用 E.coli Rosetta(DE3)对其进行大量诱导表达分析，SDS-PAGE和 Western blot的检测结果表明BmSPR融合蛋白能够在原核表达系统中稳定表达(图6)。以SP为反应底物，用分光光度法分析所纯化蛋白的酶活性的数据显示，当温度为50℃、pH值为5时，BmSPR对SP表现出良好的催化活性(图7)，为通过表达重组BmSPR的方式，开展体外合成制备BH4的课题研究提供了重要依据。

作为芳香族氨基酸羟化酶和一氧化氮合酶的重要辅酶，BH4的合成缺陷会引起肌张力低下、不明原因的高热、发育迟缓、脑脊液中神经递质代谢产物的浓度偏低等神经系统疾病［15，16］;同时也是导致高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等内皮功能异常的重要原因［16］。口服BH4已被作为临床治疗其中某些疾病的常规方案［17-19］。然而经化工合成市售的 BH4价格非常昂贵［18］。因此，低耗高效的BH4生产工艺的开发创立显得十分必要［20］。随着与BH4合成相关的酶如 GTPCHI［21］、PTPS［22］、DHPR［23］、SPR［11，24］以及DHFR［25］等的研究日益增多，酶基因的克隆与功能鉴定，蛋白质晶体结构的探明，使得BH4合成代谢的调控通路愈发清楚。这些研究一方面有助于加速对BH4缺乏症实现基因治疗的进程，另一方面为非化工途径合成BH4的应用基础研究奠定必要的理论基础。

原核表达系统是目前应用最普遍的基因工程蛋白表达系统，具有操作简单、高效低廉等明显优势［26］。我们利用大肠杆菌表达系统，获得了纯度较高、催化活性较好的重组 BmSPR(图6，7)和BmDHFR［25］。家蚕 lem突变体的幼虫体表沉积大量的SP［4，27］，本课题组已建立了从 lem 蚕高效地分离纯化SP的实验体系［27］，并且对BH4的补救合成途径所需要的两个酶进行了分子克隆和功能分析［11，25］。下一步我们打算利用从lem突变体大量提取的SP为底物，筛选共表达BmSPR和BmDHFR的工程菌，进行体外合成制备BH4的研究试验，以期获得一种较为简便有效的合成BH4的方法。

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