甲孕酮对K562/AO2 细胞及P-gp、Bcl-2耐药蛋白表达的影响*

(泰山医学院附属泰安医院肿瘤内科，山东 泰安271000)

多药耐药往往是许多白血病患者化疗失败的主要原因之一。多药耐药的机制较为复杂，其中多药耐药基因mdr1及其编码的P-糖蛋白(P-glycoprotin,P-gp)的过度表达、以及bcl-2等的过度表达是较公认的产生MDR(多药耐药)的机制[1]。本研究观察经甲孕酮作用后的K562/AO2 细胞的凋亡，以及细胞内P-gp、Bcl-2表达的变化，探讨甲孕酮耐药逆转的作用及机制。

1 材料与方法

1.1细胞系 K562、耐药K562/AO2细胞株(ADM诱导产生)购自中国协和医科大学血液病研究所, 常规培养，置37 ℃、5% CO2饱和湿度环境，培养液为含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640, 每2～3天换1次培养液。

1.2药物和试剂 阿霉素(ADM，浙江海正药业)，醋酸甲孕酮(MPA,中国药品生物制品检定所)，流式细胞仪(FACS Calibur， BD公司)，小牛血清购自杭州四季青生物工程公司，二甲基亚砜(DMSO,北京化工厂),四甲基偶氮唑兰(MTT，Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1实验分组与细胞培养方法 实验分对照组(K562/AO2细胞只加培养基不加药物)，甲孕酮组(又分为1×10-6～ 1×10-4mol/L 3个不同的浓度组)、阿霉素组、甲孕酮联合阿霉素组。取对数生长的K562/AO2细胞, 1×106/孔，接种到96孔培养板中, 设置ADM浓度10 μg/ml为工作浓度，阿霉素组加入浓度为10 μg /ml的阿霉素，甲孕酮组分别加入不同浓度的甲孕酮，甲孕酮联合阿霉素组分别加入不同浓度的甲孕酮联合浓度为10 μg /ml的阿霉素予以处理, 对照组只加等体积的培养基不加药物，每孔设9个平行孔。加入药物后继续培养48 h。

1.3.2MTT 法测定细胞抑制率 药物作用K562/AO2细胞48 h后，分对照组、阿霉素组、甲孕酮1×10-6mol/L +阿霉素组、甲孕酮1×10-5mol/L +阿霉素组和甲孕酮1×10-4mol/L +阿霉素组，每组取3个平行孔，加入MTT 20 μl，继续培养4小时后水平离心,加入150 μl DMSO,应用全自动酶标仪,选490 nm为测定波长,测定OD值, 取3孔平均值计算K562/AO2细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率=(对照组OD均值-实验组OD均值) /对照组OD均值×100%

1．3.3流式细胞术检测耐药细胞的凋亡百分率 药物作用K562/AO2细胞48 h后，每组取3个平行孔，PBS处理，70%乙醇固定(4 ℃) 24 h，加100 μl PI染液后，在避光室温条件下孵育30 min,应用流式细胞仪检测荧光强度(激发488 nm，发射670 nm波长)，用Multicycle软件分析得出相应的细胞凋亡百分率。

1.3.4流式细胞仪检测细胞Bcl- 2表达 药物作用48 h后, 分对照组(只加培养基)和甲孕酮组(分为1×10-6～ 1×10-4mol/L 3个不同的浓度组)及K562细胞组，每组样本3个复孔，用PBS洗涤 2 次，加入 100 μl破 膜 剂 、 10 μlBcl- 2/FITC 以及相应的阴性对照Mouse IgG1/FITC, 避光反应30 min后,流式细胞仪检测。实验反复3次。

1.3.5流式细胞术检测细胞P-gp表达变化 实验分对照组(只加培养基)和甲孕酮组(分为1×10-6～ 1×10-4mol/L 3个不同的浓度组)及K562细胞组，药物作用48 h后，收集细胞，75%乙醇固定30分钟后，离心，PBS洗2次分两管，均重悬于150μl PBS中，分别加入阴性对照液20 μl和P-gp单克隆抗体20 μl，用PBS调至1 ml，室温孵育30 min，上机检测。

2 结 果

2.1细胞的抑制率 单纯阿霉素组对K562 /AO2细胞系有一定的抑制作用;不同浓度的甲孕酮+阿霉素组的细胞抑制率均显著高于单纯阿霉素组(P<0.01);不同浓度的甲孕酮+阿霉素组之间细胞的抑制率有显著性差异(P<0.01)。随着甲孕酮药物浓度增加，细胞抑制率呈上升趋势。(表1)。

表1 对 K562/AO2的抑制率 、凋亡率

﹡与阿霉素组比较P<0.01；#与对照组组比较P<0.01。

2.2细胞的凋亡率 药物作用48 h后检测细胞凋亡率，甲孕酮联合阿霉素组K562/AO2细胞凋亡率较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；单纯阿霉素组与对照组相比细胞凋亡率略升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；随着甲孕酮浓度的增加，细胞凋亡率均表现增高，见表1。

2.3Bcl-2的表达率 检测K562敏感细胞的Bcl-2为低表达， K562 /AO2细胞内Bcl-2的表达率明显高，甲孕酮组细胞Bcl-2表达率明显下调;不同浓度甲孕酮组细胞Bcl-2表达率分别与对照组相比,均有显著差异(P<0. 05)。(表2)。

表2 对K562/AO2细胞Bcl-2表达率的影响

注：与对照组比较，※P<0.05。

2.4流式细胞术检测细胞P-gp的表达变化 敏感细胞K562的P-gp为低表达，检测K562 /AO2细胞内P-gp的表达率显示:甲孕酮组细胞P-gp表达率明显下调;不同浓度的甲孕酮组与对照组相比均有显著差异(P<0.05);不同浓度甲孕酮组细胞P-gp表达率分别与对照组相比,均有显著差异(P<0. 05)。(表3)。

表3 对K562/AO2细胞P-gp表达率的影响

注：与对照组比较，﹡P<0.05。

3 讨 论

临床治疗中导致肿瘤化疗失败的主要原因之一往往是肿瘤细胞的多药耐药，而导致多药耐药的机制比较复杂，其中包括抑凋亡基因的过度表达、多药耐药基因及其编码的耐药蛋白的过度表达等[2,3]，P-gp、Bcl-2的过度表达是目前较为公认的耐药机制。P-糖蛋白(P-gp)是Mdr-1基因产物，其过度表达，可使多种化疗药物泵出细胞外，减少这些药物在细胞内的积聚，从而表现为对这些药物的耐药[4]。Bcl-2基因是从滤泡性淋巴细胞瘤中分离出来的一种癌基因, Bcl-2蛋白是该基因的编码产物, 它是一种抑制细胞凋亡的基因,具有促进细胞生存,延长细胞寿命的作用，在多种肿瘤中得以表达,特别是在白血病、淋巴瘤等恶性血液肿瘤中[5,6]。在耐药肿瘤细胞中，Bcl-2蛋白异常高表达增强了其生存优势,是导致化疗耐药形成的内在生物学基础。通过下调P-gp 、Bcl-2蛋白的表达，甲孕酮可逆转K562/AO2 细胞的耐药性，使耐药肿瘤细胞重新恢复药物敏感性。因此甲孕酮与阿霉素联合能增强对肿瘤细胞的杀伤作用，增强其抗肿瘤效果。本研究结果显示10-6mol/L、10-5mol/L、 10-4mol/L浓度的甲孕酮分别作用于K562/AO2细胞株与对照组相比Bcl-2及P-gp表达减少，提示在甲孕酮作用组中Bcl-2、P-gp低表达，可使肿瘤细胞对化疗药物更敏感，更易发生凋亡，并且高浓度甲孕酮组Bcl-2 、P-gp低表达更明显，这可能是甲孕酮逆转其耐药、提高化疗敏感性，促进细胞凋亡作用的重要机制之一。

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