“双固一通”电针对老年阳虚模型大鼠淋巴细胞凋亡和促炎因子IL-6、IL-1b的影响

刘建民,王华,毛慧芳,郝青,洪亚群,彭锐,陈泽斌

“双固一通”电针对老年阳虚模型大鼠淋巴细胞凋亡和促炎因子IL-6、IL-1b的影响

刘建民,王华,毛慧芳,郝青,洪亚群,彭锐,陈泽斌

(湖北中医药大学,武汉 430061)

探讨“双固一通”电针治疗对老年阳虚模型大鼠脾脏淋巴细胞凋亡和血清促炎因子IL-6及IL-1b的影响。选用SD大鼠,随机分为正常对照组(NC)、老年阳虚模型组(Model)、“双固一通”电针组(EA)和电针对照组(EAc)。除NC组外,其余3组大鼠均通过皮下注射D-半乳糖40 d,后继续肌肉注射氢化可的松7 d,诱导为老年阳虚模型。EA组取关元、后三里和百会穴治疗,EAc组取中极、阴陵泉、印堂穴治疗。每星期治疗6次,共治疗4星期。采用Annexin V双染流式细胞术检测大鼠脾脏淋巴细胞凋亡率;酶联免疫吸附法检测血清中IL-6、IL-1b含量的变化。与NC组相比,Model组大鼠脾脏淋巴细胞凋亡率显著上升(＜0.01),血清IL-6及IL-1b含量均显著增高(＜0.01);与Model组相比,EA组和EAc组大鼠上述指标均明显降低(＜0.01,＜0.05),且EA组上述指标下降更显著,与EAc组比较,差异具有统计学意义(＜0.05)。电针能明显降低老年阳虚模型大鼠脾脏淋巴细胞凋亡率和血清中促炎因子IL-6、IL-1b的含量,提示电针对老年阳虚证导致的免疫失衡和炎性因子失衡有治疗作用,且“双固一通”配穴的电针疗效优于邻近对照配穴的疗效。

电针;阳虚证;“双固一通”电针法;细胞凋亡;白细胞介-6;白细胞介素-1b;大鼠

阳虚证为中医学基本证型之一,阳虚证的发生与个体衰老存在密切关联[1]。有学者从自然衰老角度切入为研究阳虚证提供了新的思路,有关药物调控免疫衰老效应及机制在阳虚证的探讨方面已有明确研究报道[2-3],而从免疫衰老角度探讨针灸方法对老年阳虚证的调控疗效及作用机制尚不多见。由王华教授提出的“双固一通”针灸法以中医针灸学理论为指导,将固护人体先天之本和后天之本及通泻病邪作为防治疾病要点,借助针灸作用于人体强壮要穴和阿是穴达到以外治内、固本祛邪目的[4],是针灸穴位配伍应用的新的启示和参考。近来研究显示“双固一通”针灸法在扶助正气、改善阳虚证方面具有一定的优势[5-6]。本实验以D-半乳糖和氢化可的松诱导的老年阳虚模型大鼠为研究对象,从细胞凋亡与促炎因子IL-6和IL-1b含量变化方面探讨“双固一通”电针法对老年阳虚模型大鼠免疫失衡和炎性失衡调控的效应和相关机制,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

FACS Calibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson提供);HANS-LH202H型电针仪(北京华运安特科技有限责任公司提供);KDC- 160HR高速冷冻离心机(上海嘉鹏科技有限公司提供);KHB-st360型酶标仪(上海科华公司提供);DH 3600 AB电热恒温培养箱(天津)。

胎牛血清由杭州四季青生物科技有限公司提供;RPMI-1640培养基由美国Gibco公司提供; Annexin-V细胞凋亡检测试剂盒由深圳联科生物有限公司提供;大鼠IL-6和IL-1b酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)由欣博盛生物有限公司提供。

1.2 实验分组及造模

5月龄SD健康大鼠40只[华中科技大学同济医学院实验动物学部提供,动物许可证号:SCXK(鄂)2004- 0007],均为雌性,清洁级,体重为(200±20)g,根据简单随机排序法分为正常对照组(NC)、老年阳虚模型组(Model)、“双固一通”电针组(EA)和电针对照组(EAc),每组10只。所有大鼠正常喂养1星期后,开始制作老年阳虚模型,除NC组外,其余各组按每鼠每日125 mg/kg D-半乳糖给予颈背部皮下连续注射40 d,之后再行后腿肌肉注射氢化可的松1.5 mg/100 g连续7 d,NC组大鼠每日皮下注射等量0.9%生理盐水1次,连续47 d。

1.3 治疗及处理方法

NC组采用正常饲养(以下各组略),不进行造模及电针治疗。Model组进行造模,不予电针治疗。

EA组造模成功后,参照华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》取关元、后三里和百会,采用苏州医疗用品厂有限公司出品的0.35 mm×25 mm毫针进行针刺,关元向上斜刺2～3 mm,后三里直刺2～3 mm,百会平刺5 mm。关元和后三里穴接HANS-LH202H型电针仪,选用连续波,频率2 Hz,强度为1 mA,留针15 min。每日1次,每星期6次,共治疗4星期。

EAc组造模成功后,取中极、阴陵泉、印堂,针刺和电针操作同EA组。

NC组与Model组相同方法、相同时间段内抓取固定。各组大鼠治疗结束后,禁食24 h,取材,进行相应指标检测。

1.4 标本采集

腹腔注射10%水合氯醛麻醉,左心室穿刺抽血,用干净试管收集血液,室温凝固30 min,3000 r/min离心10 min,收集血清,立即放﹣20℃冷冻保存。采血后,断颈处死大鼠,立即剖腹取出脾脏,剥离干净,生理盐水冲洗备用。

1.5 指标检测

1.5.1 脾脏淋巴细胞凋亡检测

脾脏经200目筛网研磨过滤,用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol,pH7.4)洗涤2次,每次1000 r/min各离心10 min取上清,收集细胞。用加入10%胎牛血清的1640完全培养液重悬细胞,以1×结合缓冲液(binding buffer)调整细胞浓度5×106细胞/mL,制备脾脏淋巴细胞悬液。采用流式细胞仪检测脾脏淋巴细胞百分率。具体步骤为,取100mL样品,每份样品加入500mL孵育缓冲液重悬细胞,加入5mL Annexin V -FITC和10mL PI标记溶液;轻微混匀细胞,室温下避光孵育5 min,流式细胞仪检测分析。

1.5.2 血清中IL-6和IL-1b表达水平的检测

采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定,具体步骤按试剂盒要求进行操作,最后在酶标仪450 nm处测OD值。

1.6 统计学方法

使用SPSS13.0软件进行统计学处理,所有数据均用均数±标准差表示,采用方差齐性检验和单因素方差分析,组间比较采用检验。

2 结果

2.1 模型评价

本实验采用D-半乳糖和氢化可的松诱导制作老年阳虚模型大鼠,是在黄兆胜等[7]制作阿尔茨海默病肾阳虚模型大鼠的启示下开展的。实验结果表明,造模后的大鼠表现为拱背蜷曲、肢尾冷、挤卧一起,被毛蓬松、失去光泽,足趾浮肿,舌淡胖苔润,神疲、少食、反应迟钝、小便多等虚损状,根据中医学阳虚证辨证参考标准[8],类似“阳虚”状态。

2.2 各组大鼠淋巴细胞凋亡率比较

NC组、Model组、EA组和EAc组淋巴细胞凋亡率分别为12.0%、25.9%、14.4%和21.8%。与NC组相比较,Model组大鼠淋巴细胞凋亡率显著增加(＜0.01);与Model组比较,经电针处理的EA组和EAc组大鼠淋巴细胞凋亡率均明显降低(＜0.01,＜0.05);而与EAc组比较,EA组大鼠淋巴细胞凋亡率下降更加显著(＜0.05);EA组大鼠淋巴细胞凋亡率与NC组比较,差异无统计学意义(＞0.05),而EAc组与NC组比较,差异有统计学意义(＜0.01)。这些结果表明,电针对阳虚证模型大鼠淋巴细胞凋亡率的下降均有拮抗干预作用,但“双固一通”电针法作用更显著。各组实验结果见图1。

2.3 各组大鼠血清IL-6水平比较

本研究结果显示,NC组大鼠血清IL-6含量为(111.89±14.50) pg/mL,Model组为(155.88±19.60) pg/mL,EA组为(122.65±13.80) pg/mL,EAc组为(136.65±10.50) pg/mL。Model组大鼠血清IL-6含量高于NC组,两组比较差异有统计学意义(＜0.01);经电针处理的EA组和EAc组大鼠血清IL-6含量明显低于Model组(＜0.05,＜0.01);EA组大鼠血清IL-6含量与EAc组比较,差异有统计学意义(＜0.05);EA组大鼠血清IL-6含量与NC组比较,差异无统计学意义(＞0.05);EAc组大鼠血清IL-6含量与NC组比较,差异具有统计学意义(＜0.05)。提示电针能明显降低阳虚模型大鼠血清IL-6的含量,其中“双固一通”电针法作用更显著,优于EA组。

2.4 各组大鼠血清IL-1b水平比较

本研究结果显示,NC组大鼠血清IL-b含量为(11.21±1.65) pg/mL,Model组为(15.98±1.43) pg/mL,EA组为(12.65±1.34) pg/mL,EAc组为(14.33±1.74) pg/mL。Model组大鼠血清IL-1b含量明显高于NC组(＜0.05);EA组和EAc组大鼠血清IL-1b含量明显低于Model组(＜0.05,＜0.01);EA组大鼠血清IL-1b含量与EAc组比较,差异具有统计学意义(＜0.05)。提示老年阳虚大鼠血清促炎因子IL-1b含量增多,电针能明显降低老年阳虚大鼠血清IL-1b的含量,“双固一通”电针法疗效优于EA组。

2.5 “双固一通”电针对大鼠脾脏淋巴细胞凋亡率和血清IL-6、IL-1b表达影响的相关性分析

经Spearman相关性检验表明,EA组大鼠脾淋巴细胞凋亡率与IL-6水平作相关性分析,=0.751 [0.05(8)=0.632,r0.01(8)=0.765],＜0.05。EA组大鼠脾淋巴细胞凋亡率与IL-1b水平作相关性分析,=0.646,＜0.05。提示“双固一通”电针治疗对阳虚证模型大鼠脾脏淋巴细胞凋亡率的调节与对IL-6及IL-1b表达的影响呈正相关。

3 讨论

机体随增龄出现阳虚质明显变化[9]为阳虚证的研究提供了依据,机体随增龄出现免疫功能的进行性下降,使得机体的免疫稳态失衡成为探讨阳虚证的重要切入[10]。夏世金等[2-3]把衰老机体免疫失衡和炎性失衡与阳虚证相结合的研究开辟了阳虚证研究的新方向。近来研究表明增龄性阳虚证本质中存在的免疫衰老与衰老进程中促炎性细胞因子的稳态失衡密切相关[3],其中促炎性细胞因子如TNFa、IL-6、IL-1b等细胞因子介导的炎性反应在老年阳虚机体免疫功能衰退或紊乱的发生中起着重要的作用[11-12]。而早在1996年Miller就提出免疫衰老可能与淋巴细胞过度凋亡有关[13],之后该结论无论是在动物还是人体研究中都得到了确切证实[14-15]。因此,从随增龄免疫功能的进行性下降和慢性促炎性反应进行性升高是否与淋巴细胞过度凋亡有关,对研究阳虚证的发生和针灸干预相关机制十分重要。本研究以D-半乳糖和氢化可的松诱导阳虚模型大鼠,实验发现,与正常对照大鼠相比,老年阳虚模型大鼠脾脏淋巴细胞凋亡率上升、血清促炎细胞因子IL-6及IL-1b含量增高,由此提示,增龄阳虚证本质中淋巴细胞凋亡与衰老机体的细胞炎性状态密切相关。

中医学认为,阳虚证与肾密切相关,肾为先天之本,肾阳为机体之元阳,是生命活动的原动力,临床很多疾病多与肾阳虚相关,尤以老年人为甚,故开展电针干预阳虚证作用机制对于探讨针灸防治以阳虚证为特征的疾病具有积极的意义。本实验选穴依据王华教授“双固一通”针法[4]而来,选用具有培肾固本的关元、固护脾胃的足三里和升提阳气的百会为处方。关元补肾壮阳,承阴经之海之精,历来为保健强壮、延年益寿之要穴;足三里具有健脾益胃,促气血生化之源强健,历来亦为强壮机体之要穴,临床可治诸虚百损。针刺关元、百会可补肾健脾,肾为先天之本,脾为后天之本,先天与后天相互依赖、相互滋养。百会归属督脉,别名“三阳五会”,穴居巅顶,其深处即为脑之所在。三穴合用,共奏强身固本、温阳散寒之功。

本实验结果表明,与老年阳虚模型组比较,“双固一通”电针组淋巴细胞凋亡率降低,血清IL-6及IL-1b表达亦明显降低(＜0.05,＜0.01)。提示“双固一通”电针治疗对阳虚证模型大鼠脾脏淋巴细胞凋亡率的调节与对IL-6及IL-1b表达的影响呈正相关。为证实“双固一通”针灸法选穴配伍的独特优势,本实验选取上述关元、足三里、百会三穴的邻近穴中极、阴陵泉、印堂作为对照,尽管对照治疗也取得了一定疗效,但对上述指标的影响,“双固一通”电针组与电针对照组之间比较表现出明显差异。由此提示“双固一通”电针法对老年模型大鼠淋巴细胞凋亡率、血清IL-6及IL-1b表达的拮抗干预作用更显著,效果优于非“双固一通”针灸法思想指导下的配穴电针疗效。这可能与实验已证实的选用关元、足三里两穴扶助正气,固本祛邪、激发人体潜在的抗病能力、延缓衰老作用的穴位特效性有关[16-17]。通过本实验,我们可以认为“双固一通”电针法在干预老年阳虚证机制中对免疫衰老和炎性衰老的疗效是肯定的,为改善机体阳虚乃至重建机体健康稳态具有重要意义,本实验从穴位配伍比较研究中探索电针对老年阳虚证的干预疗效和机制,为临床老年性疾病的针灸基本治疗方案提供科学依据和借鉴。至于电针通过何种途径调节淋巴细胞凋亡率和血清促炎因子IL-6、IL-1b,其中的确切机制还有待进一步探讨。

[1] 李炜弘,雍小嘉,范怀昌,等.老龄肾阳虚证的差异表达基因谱分析[J].时珍国医国药,2009,20(5):1210-1211.

[2] 夏世金,沈自尹,俞卓伟,等.炎性衰老机制与干预的实验研究[J].中国老年医学杂志,2009,29(20):2595-2598.

[3] 夏世金,俞卓伟,沈自尹.补肾法干预免疫衰老和炎性衰老重建稳态的研究[J].中国老年医学杂志,2010,30(2):265-267.

[4] 王华,梁凤霞.“双固一通”针灸法与疾病防治[J].湖北中医杂志, 2004,26(4):3-5.

[5] 唐宏图,王华.“双固一通”针法对老年阳虚患者免疫功能的影响[J].上海针灸杂志,2010,29(9):573-575.

[6] 唐宏图,陈泽斌,王华.“双固一通”针法对老年阳虚大鼠免疫功能的影响[J].湖北中医杂志,2008,30(2):6-7.

[7] 黄兆胜,孙维广,刘明平,等.养寿丹对阿尔茨海默病肾阳虚模型大鼠学习记忆的影响[J].中成药,2002,24(2):113-115.

[8] 沈自尹,王文健.中医虚证辨证参考标准[J].中西医结合杂志, 1986,6(10):598.

[9] 岑澔,王琦.不同年龄人群体质分布的调查分析[J].中华中医药学刊,2007,25(6):1126-1127.

[10] 史进方,顾国浩,张学光.免疫衰老及其免疫学预警指标[J].现代免疫学,2005,25(4):347-349.

[11] Salvioli S, Capri M, Valensin S,. Inflamm-aging, cytokines and aging: state of the art, new hypotheseson the role of mitochondria and new perspectives from systems biology[J]. Curr Pharm Des, 2006,12 (24):3161-3171.

[12] 夏世金.炎性衰老研究的现状和新策略[J].实用老年医学,2010, 24(1):7-9.

[13] Miller RA. The aging immune system: primer and prospectus[J]. Science, 1996,273(5271):70-74.

[14] 夏世金,沈自尹,俞卓伟,等.基于基因表达谱研究淫羊藿总黄酮干预老年大鼠海马炎性衰老的效果与机制[J].实用老年医学,2010, 24(1):24-27.

[15] 刘小雨,沈自尹,吴斌,等.衰老进程中大鼠淋巴细胞凋亡率的比较研究及淫羊藿总黄酮的干预作用[J].中国免疫学杂志,2007,23 (9):803-805,810.

[16] 李丽红,李丽,赵志恩,等.艾灸、中药对衰老模型大鼠线粒体DNA、血清IL-2、IL-6含量的影响[J].中国针灸,2008,28(9):681-684.

[17] 陈永,申晓亮,周曼丽,等.针灸强壮要穴对大鼠免疫功能的影响[J].上海针灸杂志,2006,25(10):48-50.

Effect of “Double Reinforcing and One Unblocking” Electroacupuncture on Lymphocyte Apoptosis and Inflammatory Factors IL-6 and IL-1β in a Rat Model of Senile Yang Deficiency

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,430061,

To investigate the effect of “double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture on splenic lymphocyte apoptosis and serum inflammatory factors IL-6 and IL-1β in a rat model of senile yang deficiency.SD rats were selected and randomly allocated to normal control group (NC), senile yang deficiency model group (model), “double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture group (EA) and electroacupuncture control group (EAc). A model of senile yang deficiency was made by 7 days’ intramuscular injection of hydrocortisone following 40 days’ subdermal injection of D-galactose in all the groups of rats except the NC group. Points Guangyuan, Housanli and Baihui were selected in the EA group and points Zhongji, Yinlingquan and Yintang, in the EAc group. Treatment was given 6 times a week for a total of 4 weeks. Rat splenic lymphocyte apoptosis rate was determined using Annexin V double staining flow cytometry. Serum IL-6 and IL-1β contents were measured by enzyme-linked immunoadsorbent assay.Splenic lymphocyte apoptosis rate and serum IL-6 and IL-1β contents increased significantly in the model group of rats compared with the NC group (both＜0.01). The above indices decreased significantly in the EA and EAc groups of rats compared with the model group (＜0.01,＜0.05). The above indices decreased more in the EA group than in the EAc group; there was a statistically significant difference (＜0.05).Electroacupuncture can significantly decrease splenic lymphocyte apoptosis and serum inflammatory factors IL-6 and IL-1β contents in a rat model of senile yang deficiency, suggesting that electroacupuncture has a therapeutic effect on immune imbalance and inflammatory factor imbalance due to senile yang deficiency. The therapeutic effect of electroacupuncture by “double reinforcing and one unblocking” point combination is better than that of electroacupuncture by control adjacent point combination.

Electroacupuncture; Yang deficiency; “Double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture; Apoptosis; Interleukin-6; Interleukin-1β; Rats

1005-0957(2014)01-0066-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.01.0066

2013-08-07

湖北省自然科学基金重点项目(2008CDA051)

刘建民(1976 - ),男,副教授,博士

王华(1955 - ),男,教授,博士生导师,研究方向为针灸穴位配伍规律研究,E-mail:Hwang.TCM@china.com