肾气丸和维生素E对D-半乳糖致衰老大鼠内耳线粒体DNA缺失率的影响△

张婷 徐飞

老年性聋的发病本质在于听觉器官的老化。衰老的分子生物学研究证实器官老化与线粒体基因突变、细胞氧化应激反应密切相关；活性氧族(ROS)产生的氧自由基损伤以及由此积累的线粒体片段缺失导致的线粒体功能障碍被认为是器官衰老的关键因素[1,2]。近年来，具有抗氧化作用的补肾中药和维生素E等氧自由基拮抗剂成为抗衰老研究的主要药物，但其在内耳老化方面的研究尚不充分。本研究旨在观察应用肾气丸和维生素E对D-半乳糖致衰老大鼠内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变的影响，为探索老年聋的有效防治措施提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 3月龄SPF级SD大鼠40只[上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物合格证号：SCXK(沪)2008-0016]，体重200～300 g，雌雄各半，经听性脑干反应(ABR)检测听力正常后分为四组：D-半乳糖组、肾气丸组、维生素E组和对照组，每组10只。

1.2主要药物与试剂 肾气丸：按《金匮要略》记载的组成与剂量制成混悬液，含量为生药1.0 g/ml；D-半乳糖(上海伯奥生物科技有限公司，25g BR，批号091218)；水合氯醛(上海化学试剂采购供应五联化工厂，250g，批号20100915)；维生素E胶丸：0.1克×30粒/盒，浙江医药股份有限公司新昌制药厂生产。

1.3实验方法

1.3.1动物造模与给药方法 D-半乳糖组给予5%D-半乳糖500 mg·kg-1·d-1颈部皮下注射，连续8周；肾气丸组给予等量5%D-半乳糖颈部皮下注射6周后再同时给予肾气丸混悬液(5 g·kg-1·d-1)灌胃2周；维生素E组大鼠给予等量5% D-半乳糖颈部皮下注射6周后，同时按250 mg·kg-1·d-1的剂量给予维生素E喂服2周；对照组不注射D-半乳糖，在实验最后2周给予等量生理盐水灌胃。

1.3.2ABR测试 各组分别于给药开始前1 d和给药结束处死前行ABR测试。大鼠用5%水合氯醛按照6 ml/kg麻醉，用GSI Audera脑干诱发电位仪进行ABR测试，以波Ⅲ为基准确定反应阈。

1.3.3内耳组织mtDNA突变检测 各组动物给药结束 ，完成ABR测试后分别处死，提取内耳组织，方法：动物断头处死，迅速取出一侧听泡置入4 ℃预冷的充氧无钙镁细胞外液中(0.1 mol/L,PBS,pH 7.4)，显微镜下解剖出耳蜗。取内耳组织(约40 mg)置于研钵中，加液氮研磨，再加约2～3 ml匀浆液(0.25 M蔗糖，30 mM Tris-HCl，10 mM Na2EDTA，2.5 mM CaCl2，pH 7.3-8.1)研磨，1 000 r/min 离心10 min，取上清12 000 r/min离心15 min，沉淀即为线粒体。

采用改良的酚-氯仿-异戊醇法提取mtDNA，采用DNA分析仪测定DNA纯度(A260nm/A280 nm> 1. 7)，并计算DNA的质量浓度(A260nm×50×DNA稀释倍数×10-3)。

PCR扩增检测mtDNA4834片段缺失：引物设计参照Gadaleta等(1989)报道的大鼠mtDNA基因组全序列，由上海生工公司合成。P1：5’-GCGAAGCTTAGAGCGTTAAC-3’ P2：5’-AGTGAGATAAGGAAGCCTGC-3’ P3：5’-AGGACTTAACCAGACCCAAACACG-3’P4：5’-CCTCTTTTCTGATAGGCGGG-3’。

按常规方法配制25 μl PCR体系，终浓度为模板DNA(mtDNA)(150 ng)，Taq酶(TaKaRa)0.5 U，引物各50 pmol/L，MgCl21.5 mmol/L，dNTP(TaKaRa)200 μmol/L。扩增条件(Bio-Rad PCR扩增仪)：首次95 ℃变性5 min；95 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；末次72 ℃延伸7 min。扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳。

1.4统计学方法 使用SPSS 13.0软件进行统计学分析，各组间ABR反应阈比较采用单因素方差分析，采用LSD-t检验和Dunnett-t检验进行各组均数间两两比较，PCR结果采用卡方检验。

2 结果

2.1ABR测试结果 各组动物实验前后ABR反应阈见表1，可见，实验前各组大鼠ABR反应阈差异无统计学意义，实验后维生素E组、D-半乳糖组和肾气丸组ABR反应阈均高于对照组(P<0.05)，但这三组之间ABR阈值差异无统计学意义( 双侧检验,P>0. 05) 。

表1 各组实验前后ABR反应阈

注：*与对照组比较，P<0.05

2.2各组大鼠内耳组织mtDNA4834 bp缺失突变检测结果 按特异性设计的引物P3和P4可得约770 bp的mtDNA保守片段，图1可见8条泳道均扩增出目的片段，说明mtDNA提取成功。

mtDNA 4834 bp缺失突变判定: 若存在mtDNA 4834 bp缺失，则引物P1和P2扩增4834 bp丢失后断裂融合基因片段长度为597 bp。如图2所示，泳道2、3、5、6、7、10、11、13在500 bp和750 bp之间有1条清晰的DNA条带，片段回收后送杭州宝成生物技术公司测序，并与Gadateta等(1989)报道的序列比较，证实存在约4 000～5 000 bp的mtDNA片段缺失。泳道4、8、9、12无此片段，是因为延伸时间较短，不足以扩增合成近5 000 bp的片段，说明4、8、9、12不存在线粒体片段缺失。

图1 大鼠内耳组织mtDNA PCR 扩增产物电泳结果

所有标本均可扩增出770 bp mtDNA 保守片段。维生素E组大鼠20耳中检出内耳组织线粒体DNA4834 bp缺失突变10耳，肾气丸组大鼠20耳中检出内耳组织线粒体DNA4834 bp缺失突变12耳，D-半乳糖组大鼠18耳(2耳标本取材失败)中检出内耳组织线粒体DNA4834 bp缺失突变16耳，对照组未检出线粒体DNA4834 bp 缺失突变；维生素E组、肾气丸组、D-半乳糖组和对照组mtDNA4834 bp缺失突变率分别为50.0%、60.0%、88.89%和0.0%。经卡方检验，肾气丸组和D-半乳糖组(双侧检验,P=0.043)、维生素E组和D-半乳糖组(双侧检验,P=0.010)之间的mtDNA4834 bp缺失率差异有明显统计学意义，肾气丸组和维生素E组的mtDNA4834 bp缺失率低于D-半乳糖组，但肾气丸组和维生素E组之间的缺失率差异无统计学意义(P=0.525)。

图2 大鼠内耳组织mtDNA PCR 扩增产物电泳结果

3 讨论

近年来，许多学者[1]认为内耳组织中mtDNA缺失水平升高是老年性聋最重要的发病机制。Seidman等[3]于1996年首次提出并证实老年大鼠mtDNA4834 bp缺失与衰老及老年性聋有一定相关性，他们提取了大鼠的大脑、听神经、耳蜗内血管纹等组织，通过PCR检测技术证实mtDNA4834的缺失阳性率与老年性聋有一定相关性。Markaryan等[4]发现老年性聋患者的颞骨标本中mtDNA 4977 bp缺失突变率平均为32%，而相同年龄正常人其缺失突变率为12%。研究表明[4]，D-半乳糖诱导的老化大鼠模型的听功能与自然老化动物相似，并伴有内耳组织中mtDNA4834 bp大片段缺失存在。本研究结果显示，D-半乳糖组大鼠ABR反应阈明显升高，其内耳组织线粒体4834 bp缺失突变率为88.89%，说明老化大鼠耳蜗组织中的mtDNA4834缺失突变与其听觉敏感性下降有关。

老化的线粒体理论(即氧自由基理论)认为，衰老或年龄相关性疾病的发生是由于氧自由基的增加，导致线粒体DNA累积性缺失和突变增加，从而引起线粒体功能障碍，能量产生少，最终影响细胞正常的生理功能。因此，国内外学者尝试应用抗氧化剂治疗老年大鼠[6，7]，发现长期使用抗氧化剂可以减缓老年性聋的进展，也可以在细胞水平上减少mtDNA的丢失和损伤，降低听力损失的程度。维生素E不但是活性氧的清除剂，也是脂质过氧化的阻断剂，维生素E能及时清除内耳老化过程中产生的氧自由基从而预防mtDNA片段缺失的累积。孔维佳等[7]的研究表明维生素E可以显著降低阿霉素诱发大鼠内耳组织线粒体DNA 4834 bp 缺失突变的发生率，说明其对线粒体DNA 有明确的保护作用。曲娴等[9]对D-半乳糖诱导所致的衰老小鼠灌服维生素E，发现维生素E能明显改善衰老小鼠学习记忆障碍，抑制脑组织一氧化氮合酶活性，降低一氧化氮含量，提高谷胱甘肽过氧化酶和琥珀酸脱氢酶活性，防止海马组织mtDNA缺失突变的发生等。从本研究结果看，维生素E组和肾气丸组ABR反应阈虽与D-半乳糖组无显著差异，但前两组内耳组织mtDNA 4838 bp缺失突变率却显著低于D-半乳糖组。说明维生素E虽是一种活性氧的清除剂，具有抗氧化特性，但并不能恢复氧自由基造成的内耳组织损伤。

中医理论认为衰老和耳聋都是肾虚的临床表现，肾虚和衰老之间存在着密切联系[10]，《素问·阴阳应象大论篇》中说：“年五十，体重，耳目不聪明矣。”肾虚与耳聋的关系则更为明确，《内经》曰：“肾气通于耳，肾和则耳能闻五音矣。”前期研究[11]发现，老龄豚鼠早期表现为耳蜗老化，并且和肾虚程度有一定的关系，加重实验动物的肾虚程度会加快其耳聋的发展。王学美等[12]的研究也证实了肾虚、衰老与外周血线粒体DNA氧化损伤之间的关系。本研究采用的补肾中药肾气丸是《金匮要略》经典方。从实验结果来看，该方与维生素E的作用类似，对大鼠内耳mtDNA 缺失突变有明显影响，但未能阻止老化大鼠的听功能变化。这可能与金匮肾气丸具有类似抗氧化剂的作用有关，如邵焕庆等[13]研究发现，金匮肾气丸能明显提高老龄大鼠体内SOD活性水平，降低MDA水平。王枫等[14]发现金匮肾气丸可以降低耳聋豚鼠血清MDA表达，并能提高SOD活力，有效清除氧自由基，从而对抗庆大霉素的耳毒性。这也提示单独使用抗氧化剂不能解决耳蜗老化问题，下一步应当关注线粒体内氧化与抗氧化平衡的关键靶点，进一步探索老年性聋可能的干预方法。

4 参考文献

1 Seidman MD, Ahmad N, Bai U. Molecular mechanisms of age-related hearing loss[J]. Ageing Res Rev,2002,1:331.

2 Huang Q, Tang J. Age-related hearing loss or presbycusis[J]. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology ,2010, 267:1 179.

3 Seidman MD, Ahmad N, Joshi D, et al. Age-related hearing loss and its association with reactive oxygen species and mitochondrial DNA damage[J]. Acta Otolaryngol,2004,552(Suppl):16.

4 Markaryan A, Nelson EG, Hinojosa R, et al. Quantification of the mitochondrial DNA common deletion in presbycusis[J]. Laryngoscope,2009,119:1 184.

5 胡钰娟，孔维佳，王琼，等. 大鼠内耳拟老化模型对卡那霉素耳毒性的易感性[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2008,43:58.

6 Darrat I, Ahmad N, Seidnan K, et al. Auditory research involving antioxidants[J]. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg,2007,15:358.

7 Peng W, Hu Y, Zhong Y, et al. Protective roles of alpha-lipoic acid in rat model of mitochondrial DNA4834bp deletion in inner ear[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2010,30:514.

8 孔维佳，韩月臣,王莹，等. 维生素E 和辅酶Q10 对大鼠内耳组织线粒体DNA 4834 bp 缺失突变的预防作用[J].中华耳鼻咽喉科杂志,2004,39:707.

9 曲娴，方文娟，李冰，等.维生素E对D-半乳糖诱致衰老小鼠脑抗氧化能力、钙稳态和线粒体DNA(mtDNA)损伤的影响[J].中国病理生理杂志,2008,24:523.

10 沈自尹.中西医结合肾本质研究回顾[J].中国中西医结合杂志,2012,32:304.

11 徐飞，丛品，王枫.“肾虚”对老龄豚鼠听觉功能影响的实验研究[J].中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志,2008, 16:81.

12 王学美,富宏,刘庚信.肾虚衰老与线粒体DNA氧化损伤关系的研究[J].中医杂志,2002,43:294.

13 邵焕庆, 王新玲, 吴茂德，等. 金匮肾气丸抗衰老机制的初步研究[J].解放军保健医学杂志, 2001, 3:105.

14 王枫,赵乌兰,魏小琴. 金匮肾气丸对耳聋豚鼠血清SOD、MDA的影响[J].浙江中医杂志,2011,46:562.