浅谈凯氏定氮法测定食品中蛋白质的原理及注意事项

费丽娜

浅谈凯氏定氮法测定食品中蛋白质的原理及注意事项

费丽娜

目的就凯氏定氮法测定食品中蛋白质的原理及注意事项进行分析。方法对凯氏定氮法测定食品中蛋白质的原理进行进一步的剖析，并对实验过程中的四个关键环节中的关键点做归纳和总结。结果该方法有取样、样品消化、蒸馏、滴定4个步骤，使用的试剂也比较多。结论实验者只有理解和掌握检验方法的原理和关键点，并在实验中加以注意，方能保证结果的准确。

凯氏定氮法；测定食品中蛋白质；原理及注意事项

蛋白质（Protein）是生命的物质基础，是生物重要的组成部分，各种酶、细胞因子都属于蛋白质，因此蛋白质的重要性不言而喻[1]。蛋白质是以氨基酸为基本单位构成的生物高分子，蛋白质参与机体中的每一个细胞和所有重要组成部分，占人体重量的20%左右，因此，蛋白质是生命物质，也是食品中重要的营养指标。蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法，它是通过测定氮含量从而换算成蛋白质的方法，是国际上通用的标准方法，其优点为实验操作简单、方便，测量结果的重复性和重现性好，而被广泛应用于各类食品、谷物、饲料等样品的蛋白质含量测定中[2]。凯氏定氮法分为常量、半微量、微量法三种方法，其原理是食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵[3]。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。该方法有取样、样品消化、蒸馏、滴定四个步骤，其原理较为复杂，使用的试剂也比较多，以下将对这四个步骤进行简单讲述。

1 样品的取样

取样应具有代表性，取样前将样品充分混匀，固体试样可用粉碎设备制成细小均匀粉末。称量放入凯氏定氮瓶时，切勿使样品粘附在瓶颈部，避免样品未消化完全而造成氮损失[4]。

2 样品的消化

样品中含氮有机化合物经硫酸在加热的条件下消化，硫酸的作用促使有机物脱水炭化[2]。含氮的有机物炭化并生成碳，碳在将硫酸还原为二氧化硫的反应中，自身则被氧化成为二氧化碳；反应过程中产生的二氧化硫将氮还原为氨气，此过程中其自身则被氧化成三氧化硫；而消化过程生成的氢，又加速了氨的形成。生成的水以水蒸气的形式连同反应过程中生成的三氧化硫一同逸出，而氨气则以硫酸铵的形式留在消化液中。

此过程的注意事项：①样品消化时，对于含糖量很高或含脂量较多的样品，应注意要缓慢升温加热，并随时注意控制加热的温度，避免产生大量泡沫喷出或喷溅到瓶壁上，造成样品的损失。若因加热温度不当，局部温度过高使消化液喷溅到瓶壁上，应及时转动凯氏定氮瓶将溅到瓶壁上的样品消化液冲下，也可在样品消化前加入少量辛醇或液体石蜡，以减少泡沫的产生。②消化时应不定时旋转凯氏定氮瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，使样品充分消化[5]。③若样品难以消化至澄清透明的程度，可将凯氏定氮瓶从加热器上取下，待其中溶液冷却至室温后，向消化液中加入少量过氧化氢，再继续加热直至完全消化。④整个消化过程中硫酸的量要充足，以保证样品中含氮有机化合物的彻底消化。样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量，因消化时脂肪消耗硫酸的量较大，使硫酸缺少而影响测定。⑤在样品消化末期，即消化液呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热半小时即可，因此时瓶内消化液温度过高，若长时间加热，会使生成的硫酸氢铵分解并释放出氨气，使氮的含量损失，从而影响测定结果。

3 蒸馏

注意事项：①水蒸气发生器中的水要呈酸性，因水中可能含有微量的氨离子，防止其受热溢出而影响测定结果。②蒸馏反应过程中，硫酸铵为强酸弱碱盐，可使消化液为弱酸性溶液。为保证测量结果的准确性，务必使结合态的氨能完全反应并释放出来，因此整个蒸馏过程中，碱液的量不足，酸碱中和反应则不彻底，很难达到使氨充分分离的目的，从而使测量结果不准确。氢氧化钠溶液既能中和样品消化液中过量的酸，又可为氨的有效分离提供一个碱性环境，因此氢氧化钠的用量要控制适当。实验者可利用消化液中含有的铜离子，根据其特征颜色作为碱性反应的指示剂。当反应室内加入氢氧化钠溶液后，其溶液颜色立即变为蓝黑色时，表明氢氧化钠已过量，能达到酸碱反应的要求，可保证反应完全进行。③加氢氧化钠的漏斗要采用水封，避免因蒸馏装置漏气造成氨的溢出而影响测定结果。

4 滴定

氨以气体的形式被释放出来，用硼酸溶液吸收后，使用盐酸或硫酸标准滴定液进行酸碱滴定，从而计算出样品中蛋白质的含量。此过程的注意事项：①硼酸吸收液的温度不宜过高，过高则氨的吸收能力将减弱，会影响测量结果，使结果偏低。最佳方式是保持溶液温度在20℃以下，或将接收瓶置于冷水浴中。②硼酸吸收液的体积不使用精密量取，只要保证能将氨全部吸收即可，因为硼酸的酸性很弱，不会影响滴定。③滴定用的标准滴定液必须按照要求进行配制和标定，因其准确度直接影响测量结果的准确性。④计算蛋白质的含量时须乘以氮换算蛋白质的系数，一般食物为6.25。

5 小结

新鲜食品中的含氮化合物大都以蛋白质为主体，所以检验食品中的蛋白质含量时，只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数6.25，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于所有动、植物食品的蛋白质含量测定，因样品中常含有核酸、生物碱等以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，所以该法测定结果为粗蛋白质含量。笔者通过参加国家机构组织的“食品中蛋白质的测定”能力检验证，以反复实验为基础，在实验过程中摸索可能影响实验结果的关键点和注意事项，严格把握实验原理，多次推敲与总结，得到上述实验经验，希望对以后的实验者能有所帮助。

[1] 马丹.凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量[J].计量与测试技术, 2008,35(06):57-58.

[2] 王燕.食品检验技术(理化部分)[M].1版.北京:中国轻工业出版社,2012:102-110.

[3] 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[M].1版.北京:中国医药科技出版社,2010:53.

[4] 张朝武.现代卫生检验[M].1版.北京:人民卫生出版社,2005: 24-56.

[5] 中国药品生物制品检定所,中国药品检验总所.药品检验仪器标准操作规程[M].1版.北京:中国医药科技出版社,2010:181-183.

R155.5

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1673-5846(2014)01-0171-02

吉林市食品药品检验所，吉林吉林 132001