禽流感H5N1亚型不同株抗原抗体相互检测相关性试验

陈海娟 胡瑞鸿 吴 琼 孙 心

（哈药集团生物疫苗有限公司，黑龙江哈尔滨 150069）

禽流感H5N1亚型不同株抗原抗体相互检测相关性试验

陈海娟 胡瑞鸿 吴 琼 孙 心

（哈药集团生物疫苗有限公司，黑龙江哈尔滨 150069）

禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）是禽流行性感冒（简称禽流感，Avian Influenza，AI）的病原。其中高致病性的H5N1亚型AIV可以造成鸡群的大批死亡，对家禽养殖业影响严重，并可引起人的感染和死亡。通过接种疫苗能有效地控制禽流感的传播，在禽流感疫苗免疫效力的评价过程中，监测免疫鸡血清抗体是最常用、最可行的方法。

2009年农业部批准重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-5株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）制造，2012年重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株）及重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-6株+Re-4株）取代以上两个产品，2014年，北方出现了新的7.2分支毒株，而禽流感Re-4株疫苗和Re-6株疫苗对这种新型流行株的保护效力并不佳。2014年4月11日，农业部发布“中华人民共和国农业部公告 第2093号”，制定了重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-7株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（Re-6株+Re-7株）2种兽药产品制造及检验规程，全国将主要以Re-6与Re-7两种疫苗联合免疫为新的趋势。

本试验分别用不同毒株的禽流感试验抗原与不同毒株禽流感疫苗免疫鸡的血清通过HI试验相互检测，对抗体效价进行分析，从而得出不同毒株的相关性。

重组禽流感灭活疫苗；不同株；相关性

1 试验材料

1.1 试验抗原

禽流感试验抗原和阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，分别为：

禽流感血凝试验抗原（H5亚型，Re-4株）2012001批

禽流感血凝试验阳性血清（H5亚型，Re-4株）201201批

禽流感血凝试验抗原（H5亚型，Re-5株）2012001批

禽流感血凝试验阳性血清（H5亚型，Re-5株）201201批

禽流感血凝试验抗原（H5亚型，Re-6株）2012001批2013003批

禽流感血凝试验阳性血清（H5亚型，Re-6株）201201批201301批

禽流感血凝试验抗原（H5亚型，Re-7株）2014001批

禽流感血凝试验阳性血清（H5亚型，Re-7株）2014001批

1.2 实验动物

21～28日龄SPF鸡，由北京梅里亚家禽有限公司提供SPF种蛋，哈药集团生物疫苗有限公司自行孵化出雏饲养至日龄。

1.3 试验疫苗

由哈药集团生物疫苗有限公司生产，分别为：

重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-5株）201210～201212批

重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株） 201220～201222批

重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株）201204～201206批

重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（Re-6 株+Re-4 株）201204～201206批 201432～201434批

重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（Re-6 株+Re-7 株）201401～201403批

2 试验方法

2.1 不同株相互检测

分别用Re-6株禽流感血凝试验抗原检测Re-5株、Re-5株+Re-4株禽流感免疫鸡血清；用Re-5株禽流感血凝试验抗原检测Re-6株、Re-6株+Re-4株禽流感免疫鸡血清；用Re-7株禽流感血凝试验抗原检测Re-6株+Re-4株禽流感免疫鸡血清；用Re-4株禽流感血凝试验抗原检测Re-6+Re-7株禽流感免疫鸡血清

2.2 红细胞凝集试验（HA）

将稀释完的96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别加入25μlPBS，再加入1%鸡红细胞悬液25μl。对照孔是50μlPBS加入25μl1%鸡红细胞悬液。

在微量振荡器振荡30s左右，室温（20～25℃）静置30～40min，判定结果。

将血凝板倾斜70°且静置10s左右开始记录，对照孔红细胞成明显的钮扣状沉到孔底。凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞对照孔一样者为完全不凝集孔（—）；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪珠状流淌者为不完全凝集孔（+）；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50%凝集孔（++）；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔（+++）；反应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔（＃）。

2.3 4HAU抗原工作液的配制及检验

以2.2标定的抗原完全凝集孔对应的最高稀释倍数为该抗原的血凝效价，除以4得到4HAU抗原的最终稀释倍数，再进行4HAU抗原的校对。将配制的4HAU抗原用PBS进行1：2、1：3、1：4、1：5、1：6和1：7稀释。

取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25μl加入到孔中，加入PBS25μl，再加入1%鸡红细胞悬液25μl。对照为50μlPBS+25μl1%鸡红细胞悬液。

以上试验做2个平行重复。

在微量振荡器振荡30s左右。室温静置30～40min，判定结果。

表6 用Re-4株试验抗原检测Re-6株+Re-7株血清（201401-201403 Re-6株+Re-7株灭活苗）

如果配制的抗原工作液为4HAU，则1：4稀释度完全凝集（＃）；如果4HAU高于4个单位，可能1：5或1：6为完全凝集；

表1 用Re-6株试验抗原检测Re-5株血清（201210-201212Re-5株灭活苗）

表2 用Re-6株试验抗原检测Re-5株+Re-4株血清（201220-201222 Re-5株+Re-4株灭活苗）

表3 用Re-5株试验抗原检测Re-6株血清（201204-201206 Re-6株灭活苗）

表4 用Re-5株试验抗原检测Re-6株+Re-4血清（201204-201206 Re-6株+Re-4灭活苗）

表5 用Re-7株试验抗原检测Re-6株+Re-4株血清（201432-201434 Re-6株+Re-4株灭活苗）

如果较低，则可能1：2或1：3为完全凝集。应根据测定结果适当调整，使抗原工作液确为4HAU。

2.4 血凝抑制试验（HI）

取96孔V型微量血凝板，第1～11孔加入25μlPBS，第12孔加入50μlPBS。随后第1孔加25μl血清，反复吹吸3～5次混匀，从第1孔吸取25μl血清加入第2孔，混匀后吸取25μl加入第3孔，如此进行倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25μl弃去。

分别向第1～11孔加入25μl的4HAU抗原工作液，在微量振荡器振荡30s左右。室温静置30分钟。

每孔加入1%鸡红细胞悬液25μl。在微量振荡器振荡30s左右。室温静置30～40min，判定结果。

3 试验结果

4 试验总结

（1）禽流感Re-5株血清中含禽流感Re-6株抗体平均相差4.8

（2）禽流感Re-5株+Re-4株血清中含禽流感Re-6株抗体平均相差4.7

（3）禽流感Re-6株血清中含禽流感Re-5株抗体平均相差2.1

（4）禽流感Re-6株+Re-4株血清中含禽流感Re-5株抗体平均相差2.2

（5）禽流感Re-6株+Re-4株血清中含禽流感Re-7株抗体平均相差5.9

（6）禽流感Re-6株+Re-7株血清中含禽流感Re-4株抗体平均相差1.2

5 结论

试验结果表明：禽流感Re-6株血清含禽流感Re-5株抗体较高，禽流感Re-7株血清含禽流感Re-4株抗体较高，反之则较低，证明重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株）可替代重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-5株），重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-7株）可替代重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-4株）。