酸处理麦秆酶解条件的优化

马俊洋,刘玲歌,吴星星,孙春然,郭聪敏,崔茂金,祝勇

（河南科技学院,河南新乡453003）

酸处理麦秆酶解条件的优化

马俊洋,刘玲歌,吴星星,孙春然,郭聪敏,崔茂金,祝勇

（河南科技学院,河南新乡453003）

以稀硫酸预处理的麦秆为底物,通过单因素试验和正交试验优化了底物的酶解条件.结果表明：酶解条件的主次顺序为底物质量浓度、酶质量浓度、酶解时间、酶解温度和pH；最佳酶解条件为底物质量浓度0.25 g/L、酶质量浓度2 g/L、酶解时间36 h、酶解温度45℃和pH为5.0,此时总还原糖含量最大为707.07 mg/g,糖含量显著增加.酶解对于提高麦秆的糖化率是非常有必要的.

麦秆；纤维素酶；酶解；总还原糖；单因素试验；正交试验

我国农作物秸秆资源非常丰富,每年产量为8.42×108t,而且以每年1.3%的速度增加[1].然而,我国的秸秆中,用作生活燃料的约占20%,用作饲料的约占15%,用作肥料还田的约占15%,用作工业原料的约占2%,直接燃烧或者被废弃的约占33%,造成了严重的环境污染和资源浪费[2].合理地利用秸秆资源不仅能够缓解能源危机和保护环境,而且能够实现农业和经济的可持续发展,是我国发展的一项重要任务.由于秸秆的组成比较复杂,性质比较稳定,使得其生物降解难以进行,因此在被生物降解前需要对其进行预处理.秸秆的预处理方法有物理法、化学法、物理化学法和生物法[3-4].常见的预处理方法有酸预处理[5-6]、碱预处理[7-8]和酶预处理[9-10].

本文对稀硫酸预处理后底物的酶解条件进行优化.首先利用单因素试验分别研究了底物质量浓度、酶质量浓度、酶解时间、酶解温度和pH对总还原糖含量的影响,在此基础上利用5因素4水平正交试验对酶解条件进一步优化.

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

1.1.1 原料麦秆来自河南省新乡市郊区,经自然晾干、粉碎后于100℃下干燥3 h,备用.

1.1.2 仪器SHA-C水浴恒温振荡器（金坛市华峰仪器有限公司）；循环水式多用真空泵（巩义市科瑞仪器有限责任公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；7200型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；FZ102微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；台式低速自动平衡离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；微量移液器（上海求精生化试剂仪器有限公司）.

1.1.3 试剂纤维素酶（西安沃尔森生物技术有限公司）；硫酸（98%,分析纯,郑州派尼化学试剂厂）；葡萄糖（分析纯,天津市德恩化学试剂有限公司）；苯酚（分析纯,天津市德恩化学试剂有限公司）；柠檬酸（分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司）；柠檬酸三钠（分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司）.

1.2 试验方法

1.2.1 酸预处理称取5.35 g麦秆于圆底烧瓶中,加入1 L体积分数为7.89%的稀硫酸溶液,摇匀,油浴125℃下处理50.31 min后取出,洗涤至中性,烘干备用.

1.2.2 酶解称取一定量的底物于50 mL圆底烧瓶中,分别加入20 mL不同pH的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液,将其放置于恒温水浴锅中在不同温度下酶解不同时间,取出后稀释一定的倍数,测吸光度.每组试验重复3次.总还原糖的测定采用苯酚-浓硫酸法[11].

1.2.3 试验设计首先利用单因素试验分别研究底物质量浓度、酶质量浓度、酶解时间、酶解温度和pH对总还原糖含量的影响,在此基础上用5因素4水平正交试验对酶解条件进一步优化.正交试验设计如表1所示.

表1 正交试验设计Tab.1 Design of orthogonal experiments

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶质量浓度的影响在温度45℃、底物质量浓度0.25 g/L、时间12 h和pH为4.8时,酶质量浓度对总还原糖含量的影响如图1所示.

图1 酶质量浓度对总还原糖含量的影响Fig.1 Effect of enzyme concentration on the content of total reducing sugars

由图1可知,随着酶质量浓度的增加,总还原糖含量逐渐增大.当酶质量浓度在3 g/L之前时有明显的增大趋势,之后随着酶质量浓度的增加总还原糖含量基本不变,这是由于暴露在外面能被纤维素酶降解的纤维素被降解完了.当酶质量浓度在3 g/L时,总还原糖含量为563.66 mg/g,酶解后总还原糖含量显著增加,说明酶解可以显著提高底物的糖化率.

2.1.2 酶解温度的影响在酶质量浓度3 g/L、底物质量浓度0.25 g/L、时间12 h和pH为4.8时,酶解温度对总还原糖含量的影响如图2所示.

图2 酶解温度对总还原糖含量的影响Fig.2 Effect of enzymatic temperature on the content of total reducing sugars

由图2可知,随着温度的升高,总还原糖含量先增加后减小.当温度为45℃时,总还原糖的含量最大,为567.33 mg/g.这是因为酶都有一个最佳温度,当温度低于最佳温度时,酶的活性没有达到最大；当温度高于最佳温度时,酶会有部分失活.

2.1.3 底物质量浓度的影响在酶质量浓度3 g/L、温度45℃、时间12 h和pH为4.8时,底物质量浓度对总还原糖含量的影响如图3所示.

图3 底物质量浓度对总还原糖含量的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on the content of total reducing sugars

由图3可知,随着底物质量浓度的增大,总还原糖含量逐渐下降.底物质量浓度在0.25 g/L时,总还原糖含量为562.32 mg/g.综合考虑酶解成本和预处理效果,选择底物质量浓度为0.25 g/L研究酶解时间和pH对总还原糖含量的影响.

2.1.4 酶解时间的影响在酶质量浓度3 g/L、温度45℃、底物质量浓度0.25 g/L和pH为4.8时,酶解时间对总还原糖含量的影响如图4所示.

图4 酶解时间对总还原糖含量的影响Fig.4 Effect of enzymatic time on the content of total reducing sugar

由图4可知,随着酶解时间的增加,总还原糖含量先增大后缓慢减小.这是由于酶解时间较长时,糖可能会部分被降解.当酶解时间为12 h时,总还原糖含量最大为566.22 mg/g.

2.1.5 pH的影响酶质量浓度为3 g/L、温度45℃、底物质量浓度0.25 g/L和时间12 h时,pH对总还原糖含量的影响如图5所示.

图5 pH对总还原糖含量的影响Fig.5 Effect of pH on the content of total reducing sugar

由图5可知,随着pH的增大,总还原糖含量先增大后减小.当pH为4.8时,总还原糖含量最大为563.39 mg/g.这是因为酶都有一个最佳的pH,在最佳pH时,酶的活性最大.

2.2 正交试验

在单因素试验的基础上设计了5因素4水平L16（45）的正交试验,正交试验设计及结果如表2所示.

表2 正交试验设计及结果Tab.2 Design and results of orthogonal experiments

由表2可知,在底物质量浓度为0.25 g/L、酶质量浓度为2 g/L、时间为36 h、温度为45℃和pH为5.0时,总还原糖含量最大为707.07 mg/g.通过极差分析可以得出,5个因素对总还原糖含量影响的主次顺序为底物质量浓度、酶质量浓度、酶解时间、酶解温度和pH.

3 结论

本文以稀硫酸预处理的麦秆为底物,通过单因素试验和正交试验优化了酶解条件,得出了如下结论：影响酶解条件因素的主次顺序为底物质量浓度、酶质量浓度、酶解时间、酶解温度和pH；最佳酶解条件是底物质量浓度为0.25 g/L、酶质量浓度为2 g/L、温度为45℃、时间为36 h和pH为5.0,此时总还原糖含量为707.07 mg/g.酶解后糖含量显著增加,说明酸预处理的麦秆酶解可以提高麦秆的糖化率.

[1]毕于运,高春雨,王亚静,等.中国秸秆资源数量估算[J].农业工程学报,2009,12（25）：211-217.

[2]严妍,接梅梅,韩姗珊.农作物秸秆综合利用方法浅析农作物秸秆综合利用方法浅析[J].污染防治技术,2010,23（4）：87-88.

[3]常娟,卢敏,尹清强,等.秸秆资源预处理研究进展[J].中国农学通报,2012,28（11）：1-8.

[4]张振,臧中盛,刘苹,等.木质纤维素预处理方法的研究进展[J].湖北农业科学,2012,51（7）：1306-1308.

[5]崔茂金,黄明贤,邓月娥.稻秆盐酸预处理产还原糖的工艺优化[J].农业环境科学学报,2014,33（3）：613-616.

[6]闫志英,姚梦吟,李旭东,等.稀硫酸预处理玉米秸秆条件的优化[J].可再生能源,2012,30（7）：104-110.

[7]崔茂金,黄明贤,贺龙娇.水稻秸秆NaOH预处理最佳条件的优化[J].河南科技学院学报：自然科学版,2012,40（4）：7-11.

[8]杨懂艳,李秀金,庞云芝,等.氨化预处理参数对麦秆厌氧消化产气性能的影响[J].农业环境科学学报,2013,32（1）：185-190.

[9]Xiao W W,Yin W,Xia S Q,et al.The study of factors affecting the enzymatic hydrolysis of cellulose after ionic liquid pretreatment[J]. Carbohydrate Polymers,2012,87（3）：2019-2023.

[10]Cui M J,Yuan Z L,Zhi X H,et al.Biohydrogen production from poplar leaves pretreated by different methods using anaerobic mixed bacteria[J].International Journal of Hydrogen Energy,2010,35（9）：4041-4047.

[11]Dubios M,Gilles K A,Hamilton J K,et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry,1956,28（3）：350-356.

（责任编辑：邓天福）

Optimization of enzymolysis conditions for wheat straw treated by acid

Ma Junyang,Liu Lingge,Wu Xingxing,Sun Chunran,Guo Congmin,Cui Maojin,Zhu Yong
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

Enzymolysis conditions were optimized by single factor experiment and orthogonal experiments using wheat straw which was pretreated by dilute sulphuric acid（H2SO4）.The results showed that the primary and secondary factors of enzymolysis conditions were substrate concentration,enzyme concentration,enzymatic time, enzymatic temperature and pH.The optimal enzymolysis conditions were substrate concentration of 0.25 g/L,enzyme condition of 2 g/L,enzymatic time of 36 h,enzymatic temperature of 45℃and pH of 5.0.The maximum of total reducing sugar concentration was 707.07 mg/g at the optimal enzymolysis conditions,sugar yield increased dramatically,indicating that enzymolysis is very necessary to improve the saccharification efficiency of wheat straw.

wheatstraw；cellulase；enzymolysis；totalreducingsugars；singlefactorexperiment；orthogonal experiments

X712

A

1008-7516（2014）04-0016-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.04.004

2014-04-28

河南科技学院大学生创新训练项目（2013CX062）

马俊洋（1991-）,男,河南南阳人.

崔茂金（1980-）,男,山东临沂人,博士,讲师.主要从事农林生物质资源化研究.