补阳还五汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡和Caspase-3基因表达的影响

任岩 曹余恒 李杰萍

脑梗死是神经系统的多发病，约占急性脑血管病的70%~80%，有较高的病死率和致残率，凋亡是脑缺血的神经细胞损伤的重要机制之一。近来研究表明，Caspase-3在各种因素启动的凋亡程序中起重要的枢纽作用。补阳还五汤为《医林改错》中的成方，由黄芪、归尾、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花七味药组成，具有补气活血、疏通经络的功效，是近代医家用于治疗中风的常用方剂之一。本实验应用大鼠脑缺血再灌注（MCAO/R）模型，经腹腔注射补阳还五汤，研究补阳还五汤对神经细胞凋亡和Caspase-3表达的影响，讨论其在脑缺血再灌注损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物 补阳还五汤成分为黄芪60 g，赤芍10 g，川芎10 g，全当归10 g，干地龙10 g，红花10 g，桃仁10 g，药材购自烟台市市直机关医院药剂科并经鉴定，按本室方法制备浓度为1.5 g/mL的水煎醇提液。具体步骤如下：（1）将生药浸入10 倍体积的蒸馏水浸泡2 h；（2）煮沸后文火煎1 h，过滤；（3）再加10倍体积的蒸馏水，煮沸后文火煎1 h，过滤；（4）重复步骤（3）；（5）将以上3次过滤液合并，浓缩成浓度为100%药液，过滤；（6）置于磁力搅拌器上，边搅拌边加入3 倍量无水乙醇，继续搅拌过夜；（7）过滤，2000 rpm/min离心30 min，取上清液；（8）上清液挥发尽乙醇，制成浓度为1.5 g/mL的溶液；（9）高压灭菌后，4 ℃保存。

1.2 制作动物模型 随机选择SPF级成年雌性Wistar大鼠40只（体重230~250 g），由烟台市滨州医学院实验动物中心提供。首先将实验动物放置于实验室内1周，保持自由进食和饮水，维持室温恒定。手术前12小时开始禁食。随机选择30只动物，按照线栓法（经左侧颈外-颈内动脉插线）建立脑缺血2 h后再灌注22 h的动物模型，术后2 h对模型是否成功进行评估，评估标准为出现左侧Horner征、提尾时右前肢屈曲、爬行时向右侧划圈行为。将20只成功建立脑缺血再灌注模型的大鼠随机平均分为阴性对照组和补阳还五汤治疗组。剩余10只未做模型的大鼠作为假手术组，假手术组动物仅在左侧颈内动脉插线后随即将线抽出。实验过程中及术后状态不佳的动物弃去不用，另取动物补充。

1.3 用药干预处理 治疗组动物在栓塞2 h后再灌注前以腹腔注射给予补阳还五汤（每公斤体重给予16 g），假手术组和阴性对照组动物腹腔注射等量的0.1 mol/L PBS缓冲液。

1.4 神经功能评分 再灌注22 h后对三组动物的神经功能进行评分。3分：栓塞对侧前肢屈曲，栓塞对侧肩部抵抗减弱，且自由活动时有划圈表现；1分：栓塞对侧前肢屈曲，肩部抵抗减弱，但无划圈；0分：无神经功能异常症状。

1.5 制备石蜡切片 每组随机选取5只大鼠，水合氯醛麻醉，仰卧位固定后，0.9%氯化钠心脏灌注，然后用4%甲醛心脏灌注，将鼠脑取出，置于4%甲醛溶液中再固定2 h，蒸馏水浸泡4 h，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。冠状位切片。

1.6 细胞凋亡检测 将石蜡切片脱蜡水化，用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Santa Cruz公司）进行操作，在荧光显微镜下用蓝色激发光照射，在高倍镜下在皮质、纹状体、海马区随机各取5个视野计数发出黄绿色荧光的阳性细胞。

1.7 免疫组化检测 将石蜡切片脱蜡水化，用即用型SABC免疫组化试剂盒试剂盒进行操作（兔抗鼠Caspase-3抗体由Santa Cruz公司提供），DAB显色（DAB染液由武汉博士德生物公司提供），用LEICA Qwin图像处理系统分析皮质、纹状体和海马区各5个视野的吸光度值（A）。

1.8 酶联免疫（ELISA）检测 每组随机选取5只大鼠，腹腔麻醉后，仰卧位固定，生理盐水心脏灌注，取出鼠脑，将其放置于液氮中快速冷冻。用超声粉碎器将鼠脑制成脑组织匀浆，离心后取上清。用ELISA试剂盒（购于BG公司）检测脑组织匀浆中的Caspas-3含量。使用酶标仪（450 nm）测OD值，绘制以OD值为纵坐标、以标准浓度为横坐标的标准曲线。然后根据样品的OD值查其在标准曲线上的浓度（单位：μg/L）。

1.9 统计学处理 应用SPSS 11.5版本统计软件进行数据统计分析，计量资料以（s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评分 假手术组术后神经功能无异常，评分为0分。阴性对照组评分（2.25±0.34）分，显著高于假手术组0分（P<0.05）。补阳还五汤组评分（1.28±0.38）分，显著低于阴性对照组（P<0.05）。

2.2 凋亡阳性细胞数 假手术组脑组织切片仅观察到散在分布的少量凋亡细胞，阴性对照组凋亡细胞数显著增多，阳性细胞主要分布于皮质、纹状体、海马。补阳还五汤组凋亡细胞数显著低于阴性对照组（P<0.05）。见表 1。

表1 三组凋亡阳性细胞数比较（s）

表1 三组凋亡阳性细胞数比较（s）

*与假手术组同区域比较，P<0.05；Δ与阴性对照组同区域比较，P<0.05

组别 皮质区 纹状体区 海马区假手术组（n=5）3.57±1.25 3.11±1.65 2.32±1.88阴性对照组（n=5）19.54±3.39* 16.35±2.77* 13.69±2.38*补阳还五汤组（n=5）8.94±2.25Δ 7.73±2.16Δ 6.20±1.67Δ

2.3 Caspase-3表达 皮质、纹状体和海马三区的Caspase-3吸光度值（A）无显著差异，故将三区数据合并统计。假手术组Caspase-3表达微弱，阴性对照组Caspase-3吸光度值（A）显著高于假手术组（P<0.05）。补阳还五汤组Caspase-3表达显著低于阴性对照组（P<0.05）。见表2。

2.4 Caspase-3浓度检测 假手术组脑组织匀浆中Caspase-3含量很低，而阴性对照组明显上升。补阳还五汤组Caspase-3含量显著低于阴性对照组（P<0.05）。见表2。

表2 三组Caspase-3吸光度值和定量检测比较（s）

表2 三组Caspase-3吸光度值和定量检测比较（s）

*与假手术组比较，P<0.05；Δ与阴性对照组比较，P<0.05

组别 吸光度值（A）浓度（μg/L）假手术组（n=5）0.19±0.09 15.48±2.66阳性对照组（n=5）0.67±0.20* 48.33±5.78*补阳还五汤组（n=5）0.25±0.13Δ 23.96±4.01Δ

3 讨论

补阳还五汤是一剂补气活血通络的方药，主治中风后遗症，如半身不遂、口眼歪斜、语言艰涩、遗尿不禁等。此方由清代名医王清任创立，为后世医家所推崇，沿用至今已一百多年。王氏认为，中风的病机为气虚血滞导致脑络淤阻，气虚为本，血瘀为标，方剂中的君臣佐使各药主要起补气活血的作用。这是中医中补阳还五汤的药理机制。如今，随着人们对脑中风的病理机制的研究逐渐深化，脑缺血后细胞和分子水平的病理机制正在逐渐被揭示。

Nitatori T等人在上个世纪发现脑缺血再灌注后，海马CAl区出现迟发性神经细胞死亡。目前已有大量研究都证实这种迟发性神经元死亡与细胞凋亡关系密切，提示脑缺血的神经细胞损伤不只是坏死，而且与凋亡密切相关。当脑缺血再灌注发生之后，坏死和凋亡同时发生，坏死细胞主要集中在缺血中心区，而凋亡细胞主要集中在缺血周围区。随着再灌注时间加长，缺血周围区的凋亡细胞数量会逐渐增加，到24 h达到高峰。这说明在脑缺血引发的细胞渐进死亡过程中，细胞凋亡是一种重要形式。所以，抗凋亡是脑缺血的一种必要的治疗手段。

Caspase-3蛋白是参与凋亡过程的一种重要的蛋白质。脑缺血时，Caspase-3蛋白表达也明显升高，而且Caspase-3的表达与细胞凋亡的动态变化一致，两者不仅在相同区域出现，并且几乎同时达到高峰，因此Caspase-3与缺血性神经元凋亡的关系非常密切。研究显示，Caspase-3是介导凋亡的一种重要的蛋白酶，在脑缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡过程中起着关键作用[1-2]。

笔者的研究结果发现，脑缺血及再灌注模型组神经元凋亡细胞和Caspase-3的表达明显增多，补阳还五汤组神经细胞的凋亡受到了抑制，并减少了Caspase-3的表达，从而证明了补阳还五汤治疗中风的机制与抗神经元细胞凋亡有关，并且其抗凋亡的机制之一是通过调控Caspase-3基因表达实现的，但这种调控的分子机制以及是否同时合并其他的调控机制还有待进一步的研究。

[1]Bmnghton B R， Reutens D C， Sobey C G. Apoptotie mechanisms after cerebral isehernia[J]. Strob，2009，40（5）：331-339.

[2]Moroni F. Poly （ADP-ribose）polymerase 1（PARP-1）and postischemic brain damage[J]. Curr Opin Pharmacol，2008，8（1）：96-103.