项丛刺针法对缺血性脑卒中后遗症大鼠BDNF、NGF以及神经行为学的影响

章显宝,汪瑛,王震,孔红兵,汪节,江六顺,郭晓利,肖伟

(安徽中医学院附属针灸医院,合肥 230061)

项丛刺针法对缺血性脑卒中后遗症大鼠BDNF、NGF以及神经行为学的影响

章显宝,汪瑛,王震,孔红兵,汪节,江六顺,郭晓利,肖伟

(安徽中医学院附属针灸医院,合肥 230061)

目的观察项丛刺针法对缺血性脑卒中后遗症大鼠海马区BDNF、 NGF以及神经行为学的影响。方法80只雄性青年清洁健康级Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、治疗组、西药组,每组20只。除假手术组外,其他动物均采用线栓法阻断大脑中动脉制备大鼠脑缺血模型。疗程结束后,观察大鼠神经行为评分的变化,采用免疫组织化学染色方法检测各组大鼠海马区BDNF、NGF的表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠海马区BDNF、NGF的表达显著升高(P＜0.01);与模型组比较,治疗组与西药组大鼠海马区BDNF、NGF的表达均显著升高(P＜0.01);与西药组相比,治疗组效果显著(P＜0.05);与假手术组相比,模型组大鼠神经行为学评分显著增高(P＜0.01);与模型组相比,治疗组与西药组大鼠神经行为学评分显著降低(P＜0.01);与西药组相比,治疗组效果显著(P＜0.05)。结论项丛刺针法对缺血性脑卒中后遗症大鼠脑组织有神经保护和修复作用,疗效优于西药,其作用机制可能涉及有效上调大鼠BDNF、NGF蛋白的表达。

针刺;项丛刺针法;中风后遗症;BDNF;NGF;神经行为学;大鼠;穴位,头颈部

缺血性脑卒中因具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点而一直倍受关注,如何积极有效地促进缺血性脑卒中患者神经功能恢复是目前的研究热点。随着神经发生现象在成年个体神经组织中的发现以及对其研究的不断深入,为修复神经组织治疗方法的实现提供了可能,并因此而受到了国内外学者的广泛关注[1-2]。有研究表明,脑源性神经营养因子(brain-derived neuro t rophic factor,BDNF)和神经生长因子(nerve growth factor,NGF)可以明显促进缺血后神经元的存活和生长发育并能够防止他们受损死亡,改善神经元的病理状态,促进受损神经元再生及分化成熟,在中枢神经系统损伤修复中具有重要的作用[3]。针刺对缺血性脑卒中的治疗已被国内外公认[4-5],我们的前期工作也证实,针刺治疗能明显改善缺血性脑卒中后遗症患者的神经系统症状,改善患者生活质量及预后[6-7]。临床上对于缺血性脑病患者的治疗是长期的,尤其针刺疗法是治疗缺血性脑血管疾病后遗症的有效方法之一,但对其作用机制,如促进大脑可塑性形成等方面缺乏深入探讨。因此,我们选择应用项丛刺针法观察针刺对缺血性脑卒中大鼠海马区BDNF、NGF表达及其神经行为学的影响,并探讨其可能的作用机制,为临床针刺治疗缺血性脑卒中提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

雄性青年清洁健康级Wistar大鼠80只,体重(300±20)g,月龄为9个月,由安徽医科大学实验动物中心提供(动物合格证号为皖医实动准第01号)。实验前观察饲养1星期,标准化环境饲养。随机数字表法分为假手术组、模型组、治疗组、西药组,每组20只。

1.2 试剂

兔抗大鼠BDNF(武汉博士德生物工程有限公司产品);抗体兔抗大鼠NGF抗体(武汉博士德生物工程有限公司产品);生物素标记二抗(武汉博士德生物工程有限公司产品)。

1.3 模型制备

采用改良线栓法制作大鼠右侧MCAO局灶性脑缺血模型。假手术组大鼠麻醉后,仅暴露颈内外动脉分叉,不闭塞大脑中动脉。术中用肛表-电热毯反馈装置保持肛温在(37±0.5)℃。术后腹腔内注射0.2万U青霉素以预防感染,回笼后常规喂养。术后至处死前若有大鼠死亡,则补以同批次相似体质量大鼠。模型成功的标志是动物麻醉清醒后出现左前肢无力向左侧方爬行,或者朝左侧转圈爬行,且无烦躁不安。

1.4 实验干预方法

造模成功5星期后开始行针刺治疗,根据“大鼠穴位图谱”(江苏省中医药研究所华兴邦研究员等用模拟骨度法绘制而成),项丛刺取穴共9个穴点。①脑后正中线上取风府、哑门、下脑户(枕骨粗隆下方约风府穴上1寸处)。②分别以两风池与风府沿颅底作一连线,左右各分成3等份,每1等份为1个穴位。针刺时将大鼠轻轻放在特制的固定器内,大鼠保持清醒安静状态。穴位皮肤常规消毒后,选用苏州医疗用品厂有限公司生产的华佗牌不锈钢毫针,规格为直径0.20 mm,针身长25～50 mm,毫针与穴位皮肤呈垂直方向刺入2 mm,并采用平补平泻的捻转手法,捻转角度60°左右,留针15 min,留针期间各行针1～2次,每日1次,最长疗程为15 d。西药组给予尼莫地平片12 mg/kg溶入生理盐水进行灌胃,每日1次,最长疗程为15 d。模型组、假手术组大鼠在实验开始后常规饲养,不作任何治疗。

1.5 神经行为学评分

模型复制后4 d,进行初次神经行为学评分,测试假手术组和已造模的大鼠;针刺组和西药组在末次治疗结束后分别进行神经行为学评分;模型组和假手术组的神经行为学评分与针刺组平行进行。评分标准按Longa等[8]制定的5级评分法,0分为无功能障碍;1分为不能伸展前肢;2分为向一侧旋转;3分为向一侧倾倒;4分为无自主活动伴意识抑制(取评分为1、2、3分者进入实验)。

1.6 标本采集及处理

疗程结束后,大鼠经神经行为学评分完成后进行脑组织的取材。以10%水合氯醛麻醉大鼠,开胸暴露心脏,将灌注针头从心尖部插入升主动脉,同时迅速剪开右心耳,依次迅速灌注20℃生理盐水200 mL、4℃4%多聚甲醛200 mL,迅速取脑,置于4℃4%多聚甲醛固定液中过夜。每组大鼠取同部位进行切片,参照《大鼠脑立体定位图谱》[9]取海马区,常规上行脱水、二甲苯透明后石蜡包埋,连续切片,切片厚20 µm,然后在温水中充分展开,贴片。每份组织取不相邻切片3张备用。

1.7 免疫组织化学染色

切片经二甲苯脱蜡,脱蜡后在清水中冲洗一段时间,加入3%H2O2泡10 min,从而除去内源性的过氧化氢酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗2次,再加入柠檬酸缓冲液,放入微波炉中蒸煮3 min(中火),冷却至室温,然后再蒸煮一次,冷却至室温;将柠檬酸缓冲液倒掉,水洗2次,并将载玻片置于PBS中5 min,洗2次,擦干组织周围的PBS液,滴加正常山羊血清,使一些非特异性的位点封闭起来,然后放入37℃温箱中30 min;滴加适当稀释的一抗(1：100),4℃冰箱过夜;将载玻片从冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5 min,擦干组织周围的PBS后加上生物素标记二抗,然后置于37℃温箱中30 min;将载玻片从温箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5 min,擦干组织周围的PBS后加上SABC,然后置于37℃温箱中30 min;将载玻片从温箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5 min,擦干组织周围的PBS后加上显色剂;将显色后的载玻片用清水冲洗一段时间后,浸泡于苏木精中染色30 s;将复染后的载玻片置于水中冲洗后,进梯度乙醇脱水。最后浸泡在二甲苯中,搬到通风柜中。用中性树胶滴在组织旁边,封好片子晾干。对照试验以正常血清和PBS代替一抗,同步进行上述免疫组织化学染色,结果为阴性。

1.8 细胞计数及统计

将已染好的切片在显微镜下放大400倍,每只大鼠取3张相同海马区域脑片,每张脑片在海马随机选取10个视野,计数此区域内免疫组化染色阳性细胞数,求其平均值。实验测得各组数据采用均值±标准差表示,两样本均数比较采用t检验,多个样本均数比较采用单因素方差分析。统计结果用Spssforwindows11.0软件分析。P＜0.05认为有显著性差异,P ＜0.01有非常显著性差异。

2 结果

2.1 各组大鼠海马区BDNF、NGF阳性细胞数的表达

BDNF、NGF阳性细胞在光镜下呈蓝色与棕色相叠的点状、三角状、索状或片状表达痕迹。其免疫阳性颗粒主要分布在胞浆和细胞膜表面、主干树突和近细胞膜的胞浆处,染色较深,而包体中央细胞核处呈淡蓝色。经过1个疗程治疗后,假手术组大鼠在与模型组、针刺组、西药组相应区域相比仅见少量BDNF和NGF的表达,而模型组、针刺组、西药组海马区BDNF和NGF阳性细胞数比假手术显著增多(见图1、图2)(P＜0.01);针刺组、西药组海马区BDNF和NGF阳性细胞数较模型组增多(见图1、图2)(P＜0.01);而与西药组比,针刺组海马区BDNF、NGF阳性细胞数的表达较多(见图1、图2)(P ＜0.05)。各组数据统计结果见表1。

表1 各组大鼠海马区BDNF、NGF阳性细胞数表达的比较(±s)

表1 各组大鼠海马区BDNF、NGF阳性细胞数表达的比较(±s)

注：与假手术组比1)P＜0.01;与模型组比2)P＜0.01;与西药组比3)P＜0.05

组别 n BDNF NGF假手术组 20 3.60±1.31 4.45±1.39模型组 20 24.85±3.541)24.15±2.831)针刺组 20 33.35±3.101)2)3)34.25±2.381)2)3)西药组 20 31.40±2.991)2)32.80±2.171)2)

图1 各组大鼠海马区BDNF阳性细胞的表达(×400)

图2 各组大鼠海马区NGF阳性细胞的表达(×400)

2.2 各组大鼠神经行为学评分结果

疗程结束后,对各组大鼠进行神经行为学评分,结果见表2。与假手术组比较,模型组大鼠神经行为学评分显著升高(P＜0.01);与模型组比较,针刺组与西药组大鼠神经行为学评分显著降低(P＜0.01);与西药组比较,针刺组在降低大鼠神经行为学评分效果更佳(P ＜0.05)。

表2 各组大鼠神经行为学评分结果的比较 (±s,分)

表2 各组大鼠神经行为学评分结果的比较 (±s,分)

注：与假手术比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01;与西药组比较3)P ＜0.05

组别 n 神经行为学评分假手术组 20 0.00±0.00模型组 20 2.56±0.851)针刺组 20 1.00±0.562)3)西药组 20 1.65±0.722)

3 讨论

3.1 项丛刺针法对缺血性脑卒中后遗症大鼠海马区BDNF、NGF表达的影响

BDNF和NGF同属神经生长因子家族,又称神经营养素(Neurot rophins,NTs),是近年来在神经再生、损伤修复领域内的研究热点。BDNF和NGF由神经元和神经元支配的靶器官或星形胶质细胞产生,具有多种生物活性。BDNF及NGF在中枢神经系统发育过程中起重要作用,同时维持成熟的中枢及周围神经系统神经元的正常功能[10]。BDNF可支持和促进纹状体多巴胺能神经元、前脑胆碱能神经元、视网膜神经节细胞、颅脑和脊髓的运动神经元的存活和生长,而在胚胎发育的早期,NGF也能明显促进神经前体细胞的增殖并促进其分化。有研究表明,BDNF、NGF对缺血性脑损伤的神经元有保护作用,能阻断脑缺血时神经元凋亡的发生[11-12]。脑缺血后,脑神经细胞的损伤程度与BDNF和NGF的表达水平密切相关,BDNF及其受体TrkB表达、NGF均增加,两者水平增高能够提高神经元的抗损伤能力[13-14]。因此,脑缺血后增加的BDNF、NGF对缺血性脑损伤具有保护作用。

本实验显示,在大鼠造模后5星期、治疗15 d后,模型组、针刺组、西药组大鼠海马区BDNF和NGF表达与假手术组大鼠的表达均有显著性差异。表明脑组织发生缺血后,脑组织BDNF、NGF表达均增加。有研究显示[15],在神经损伤3 d后BDNF mRNA开始缓慢增加,3～4星期达到最高峰。Hsu等[16]研究发现,将大鼠右侧大脑中动脉闭塞30rain再开放,4 h后缺血侧皮质NGF表达增加,1～3 d表达明显受抑制,但1～2星期出现第2次高峰。本实验时间点由于选取在大鼠造模后5星期开始治疗,故尚无法观察BDNF、NGF在脑缺血损伤后的变化规律。但针刺组、西药组大鼠海马区BDNF和NGF表达与模型组大鼠的表达均有显著性差异,说明针刺和药物均可以提高大鼠BDNF、NGF在脑内的表达且保持在较高水平。持续较高水平的BDNF、NGF可以促进缺血后神经元的存活和生长发育并能够防止他们受损死亡,改善神经元的病理状态,促进受损神经元再生及分化成熟,对中枢神经系统损伤修复起到重要的作用[3]。而针刺组与西药组相比,大鼠海马区BDNF、NGF表达更明显,两者比较有显著性差异,表明针刺在提高大鼠BDNF、NGF表达方面效果更优于西药。

3.2 项丛刺针法对缺血性脑卒中后遗症大鼠神经行为学的影响

神经功能缺损评分不仅可评价大脑中动脉栓塞(MACO)模型制备是否成功,而且是观测针刺对MACO大鼠治疗作用的评判标准,与BDNF、NGF组织学观察相结合可反映针刺对受损神经的修复及保护作用。

本实验在疗程结束后采用目前常用的神经行为学评分法——改良Longa法,对大鼠进行神经功能缺损的评分。结果显示,假手术组的神经功能缺损评分为0分,表明该组手术操作没有造成脑动脉闭塞,因而不会出现脑缺血的症状和体征。模型组的神经功能缺损评分较高,表明大脑中动脉的闭塞造成了大鼠的神经功能缺损,结合模型组大鼠海马区BDNF、NGF表达,可以看出在脑缺血后脑内BDNF、NGF表达的增高,未能完全改善大鼠的神经功能。而与模型组比较,针刺组、西药组大鼠神经行为学评分显著降低。表明针刺及药物的治疗有助于大鼠神经功能的康复,其作用机制可能是针刺和药物治疗增强了内源性BDNF和NGF的表达,从而有助于减轻脑缺血后神经元的损伤程度,保护受损神经元。针刺组与药物组相比,大鼠的神经行为学评分更低,表明针刺对大鼠神经功能的修复效果优于西药。

综上所述,项丛刺针法对缺血性脑卒中后遗症大鼠脑组织有神经保护和修复作用,疗效优于西药,其作用机制可能涉及有效上调大鼠BDNF、NGF蛋白的表达。当然,针刺对缺血性脑卒中大鼠脑损伤的康复作用可能是一种综合调整的结果,其作用机理包括许多方面,增强其缺血脑组织的BDNF、NGF表达可能只是其中机制之一。我们将在以后的研究中进一步探索针刺治疗缺血性脑卒中的作用机制,为临床治疗缺血性脑卒中提供更多的实验依据。

[1]Ming GL, Song H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system[J]. Annu Rev Neurosci, 2005,28：223-250.

[2]Taupin P. Neurogenesis in the adult centraI nervous system[J]. CR Biol, 2006,329(7)：465-475.

[3]董为伟.神经保护的基础与临床[M].北京：科学出版社,2002：239-245.

[4]Hu ZC, Wu YC, Wang NH. Clinical study on acupuncture treatment of post-stroke depression in recent ten years[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2011,9(5)：324-330.

[5]Zhang Y, Liu GC, Wang JY, et al. Clinical observation on acupuncture treatment for post-stroke spastic hem iplegia[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2013,11(4)：230-234.

[6]肖伟,孔红兵,王震,等.项从刺合氟西汀治疗卒中后抑郁临床研究[J].中医药临床杂志,2009,21(4)：330-331.

[7]梁慧,陈炜,林飞.手十二井穴放血为主治疗脑卒中后抑郁状态临床观察[J].上海针灸杂志,2013,32(6)：457-458.

[8]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible m iddle cerebral artery occlusion w ithout craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1)：84-91.

[9]包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京：人民卫生出版社,1991：26-32.

[10]Mitchell JJ, Paiva M, Walker DW, et al. BDNF and NGF afford in vitro neuroprotection against ethanol combined with acute ischem ia and chronic hypoglycem ia[J]. Dev Neurosci, 1999,21(1)：68-75.

[11]Koda M, Murakam i M, Ino H, et al. Brain-derived neurotrophic factor suppresses delayed apoptosis of oligodendrocytes after spinal cord injury in rats[J]. J Neurotrauma, 2002,19(6)：777-785.

[12]Garrido R, Toborek M. Nicotine up-regulates expression of neurotrophic factors and attenuates apoptosis of spinal cord neurons[J]. J Neurochem istry, 2003,85(2 Suppl)：26.

[13]Kirkland RA, Saavedra GM, Frank lin JL. Rapid activation of antioxidant defenses by nerve grow th factor suppresses reactive oxygen species during neuronal apoptosis: evidence for a role in cytochrome credistribution[J]. J Neurosci, 2007,27(42)：11315-11326.

[14]Jia HP, Schutte BC, Schudy A, et al. Discovery of new human betadefensins using a genom ics-based approach[J]. Gene, 2001,263 (1-2)：211-218.

[15]曾赵军,罗学港.脑源性神经营养因子对神经损伤的修复与再生[J].国外医学：生理、病理科学与临床分册,2001,21(4)：317-319.

[16]Hsu CY, An G, Liu JS, et al. Expression of immediate early gene and grow th factor mRNAs in a focal cerebral ischem ia model in the rat[J]. Stroke, 1993,24(12 Suppl)：178-181.

Effect of Nape Cluster Acupuncture on BDNF, NGF and Neurobehaviors in Rats with Post-ischem ic Stroke Sequelae

ZHANG Xian-bao, WANG Ying, WANG Zhen, KONG Hong-bing, WANG Jie, JIANG Liu-shun, GUO Xiao-li, XIAO Wei. Anhui College of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230061,China

ObjectiveTo investigate the effect of nape cluster acupuncture on hippocampal BDNF and NGF and neurobehaviors in rats with post-ischem ic stroke sequelae.MethodEighty clean and healthy young male Wistar rats were random ly allocated to sham operation, model, treatment and Western drug groups, 20 rats each. A rat model of cerebral ischem ia was made by thread occlusion of the m iddle cerebral artery in all the groups except the sham operation group. After the end of treatment, rat neurobehaviors were scored and hippocampal BDNF and NGF expressions were exam ined by immunohistochemical staining in every group of rats.ResultCompared with the sham operation group of rats, hippocampal BDNF and NGF expressions increased significantly in the model group (P＜0.01). Compared with the model group of rats, hippocampal BDNF and NGF expressions increased significantly in both the treatment and Western drug groups (P＜0.01). Compared with the Western drug group, the effect was marked in the treatment group (P＜0.05). Compared with the sham operation group of rats, the neurobehavior score increased significantly in the model group (P＜0.01). Compared with the model group of rats, the neurobehavior score decreased significantly in both the treatment and Western drug groups (P＜0.01). Compared with the Western drug group, the effect was marked in the treatment group (P＜0.05).ConclusionNape cluster acupuncture has protecting and repairing effects on brain tissue in rats with post-ischemic stroke sequelae. Its therapeutic effect is superior to that of Western drugs. The mechanism of its action may involve effective up-regulation of rat BDNF and NGF protein expressions.

Acupuncture; Nape cluster acupuncture; Poststroke syndrome; BDNF; NGF; Neuroethology; Points, head & neck

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.02.0181

1005-0957(2014)02-0181-04

2013-06-30

安徽省高等学校省级自然科学研究项目(KJ20011A186)

章显宝(1984 - ),男,硕士,E-mail：r rzxb@163.com

肖伟(1961 - ),女,主任医师,硕士生导师,研究方向为针灸对脑血管病临床及其作用机制研究,Emai l：xiaowei1216@ gmail.com