针刺抗哮喘差异表达蛋白的生物信息学分析

冉君,尹磊淼,王宇,徐玉东,刘艳艳,杨永清

(1.上海中医药大学,上海 201203;2.上海市针灸经络研究所,上海 200030)

·综 述·

针刺抗哮喘差异表达蛋白的生物信息学分析

冉君1,尹磊淼2,王宇2,徐玉东2,刘艳艳2,杨永清1

(1.上海中医药大学,上海 201203;2.上海市针灸经络研究所,上海 200030)

目的对针刺抗哮喘差异表达蛋白的生物学功能和分子网络进行分析,探讨生物信息学方法在针灸研究中的应用和思路。方法利用分类系统(PANTHER)、信号通路交互作用数据库(Pathway Interaction Database,PID)、分子网络作用软件(Ingenuity Pathway Analysis,IPA)分别对针刺抗哮喘差异表达蛋白进行分子生物功能注释、信号通路、蛋白相互作用和分子调控网络分析。结果多个针刺抗哮喘差异表达蛋白与免疫系统功能密切相关,涉及了RhoA信号通路、Toll样受体信号通路、嗜酸性粒细胞Ccr3信号通路、T细胞IL-2R beta活化通路等生物通路,通过调控下游细胞因子,影响CD4分子的功能,发挥免疫调节作用。结论通过对针刺抗哮喘差异表达蛋白的生物信息学分析获得了针刺抗哮喘作用免疫相关分子通路和调控靶点,为进一步研究针刺抗哮喘的免疫相关分子机制奠定基础。

针刺;哮喘;差异表达蛋白;生物信息学

支气管哮喘是世界范围内严重影响人类身心健康的呼吸道慢性变态反应性疾病,全球约有3亿人罹患哮喘,我国大约有3 000万哮喘患者,其发病率和死亡率在世界范围内呈逐年增高趋势[1-2]。针灸在防治哮喘的过程中发挥了积极作用[3-5],我们采用河南中医学院邵经明教授60余年经验总结的“三穴五针”方法治疗哮喘[6],取得了良好的临床疗效。临床和动物实验研究均证实针刺治疗具有免疫调节作用。本课题组前期开展了针刺抗哮喘差异蛋白质组学研究,鉴定了针刺抗哮喘血清和肺组织中的差异表达蛋白[7-8]。本次研究采用生物信息学分析方法,利用PANTHER、PID、IPA等在线分析工具对这些针刺抗哮喘差异表达蛋白进行生物功能和分子网络作用分析,为进一步研究针刺抗哮喘分子机制和调节靶点提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 针刺抗哮喘差异表达蛋白

针刺抗哮喘差异表达蛋白来自课题组前期通过蛋白质组学技术鉴定的针刺治疗哮喘特异性差异表达蛋白[7-8],见表1。

1.2 生物信息学分析方法

1.2.1 GO(基因本体)分子生物功能注释

在线分类系统PANTHER(http://www.pantherdb. org/)采用基因本体分类方法,可以从分子功能、生物学过程、生物通路3方面对蛋白质、基因及转录物进行分类。该研究主要是通过PANTHER分析针刺抗哮喘差异表达蛋白所涉及的生物学过程。

表1 针刺抗哮喘差异表达蛋白

1.2.2 信号通路分析

通路相互作用数据库PID(Pathway Interaction Database,http://pid.nci.nih.gov/),是由美国国立癌症研究所(NCI)和自然出版集团(NPG)共同创立,截止到2012年9月提供了16 823条细胞信号转导、调节活动及主要细胞生命的蛋白质路径信息[9]。本次研究通过该数据库查询针刺抗哮喘差异表达蛋白所涉及的信号通路。

1.2.3 蛋白相互作用分析

IPA(Ingenuity Pathway Analysis,http://www. qiagen.com/)是一款一体化的基于网络的软件应用程序,可实现基因表达、miRNA和SNP微阵列及代谢组学、蛋白质组学和RNAseq实验数据的分析、整合和理解。该软件已被世界顶尖的制药公司和科研机构广泛使用,至今引用该软件发表的高水平科研文献已超过3 000 篇[10]。本研究主要选择该软件核心分析功能(Core analysis),构建了蛋白相互作用可视化网络。

1.2.4 分子调控网络分析

IPA软件整合了基因组、转录组、蛋白质组、代谢组,以及生物大分子之间及与药物小分子的相互作用网络,通过IPA路径挖掘(Path Explorer)功能可以对目的分子进行特定靶点、分子上下游调控、候选生物标记物、药物毒性分析等。本次研究主要对针刺抗哮喘差异表达蛋白进行分子上下游调控分析。

2 结果

2.1 针刺抗哮喘差异表达蛋白GO生物功能

通过PANTHER在线分析工具对针刺抗哮喘差异表达蛋白进行生物学过程功能注释。结果显示见图1。这些差异表达蛋白主要涉及了代谢过程、细胞过程、细胞定位、免疫系统过程、细胞组成和生源、生物进展过程、生物调节、生物粘附、应激反应9类生物学功能。其中免疫系统功能分类中包括了CypA、S100A8、S100A9、S100A11、RAGE等针刺抗哮喘差异表达蛋白,说明针刺抗哮喘效应与这几个蛋白的免疫调节作用相关。

图1 基于PANTHER分类系统的针刺抗哮喘差异表达蛋白生物功能分类

2.2 针刺抗哮喘差异蛋白信号通路

通过PID数据库对针刺抗哮喘差异表达蛋白分布的信号转导通路进行分析。结果见表2,针刺抗哮喘差异蛋白主要参与RhoA信号通路(RhoA signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Endogenous TLR signaling)、嗜酸性粒细胞Ccr3信号通路(Ccr3 signaling in eosinophils)、细胞粘附通路(Cell to cell adhesion signaling)、T细胞IL-2R beta活化通路(Il-2 receptor beta chain in t cell activation)、整合素信号通路(Integrin signaling pathway)等生物通路。这些信号通路与免疫、炎症、T细胞和嗜酸性粒细胞活化作用密切相关,说明针刺可以通过调节这些信号通路发挥抗哮喘作用。

表2 基于PID数据库的针刺抗哮喘差异表达蛋白信号通路分析

2.3 针刺抗哮喘差异表达蛋白相互作用分析

将针刺抗哮喘差异表达蛋白用IPA软件进行蛋白-蛋白相互作用网络分析,发现其中有10个针刺抗哮喘差异表达蛋白存在直接或间接的相互作用关系。详见图2。该网络图显示,这10个差异表达蛋白分布在细胞的各个部位,如位于细胞膜外的CC10、Alb、Prss1,细胞膜上的Anxa5、RAGE,细胞质中的Prdx6、CypA、S100A8、S100A9以及细胞核中的Cfl1蛋白,这为针刺的信号传导提供了空间基础;其中CC10、CypA、RAGE可以调节其他多个蛋白,说明这两个蛋白在针刺抗哮喘过程中可能具有上游的调节作用,而S100A8、S100A9则受到多个蛋白的调节,提示这两个蛋白在针刺抗哮喘过程中可能具有下游的效应作用。

图2 基于IPA软件的针刺抗哮喘差异表达蛋白的蛋白-蛋白相互作用

绿色分子是针刺抗哮喘差异表达蛋白,白色分子是组建网络所需分子。实线表示直接联系,虚线表示间接联系,箭头表示作用方向。

2.4 针刺抗哮喘差异蛋白分子调控分析

利用IPA路径挖掘功能对CC10、S100A8、CypA几个关键蛋白进行分子调控网络分析。结果显示见图3,CC10蛋白受到糖皮质激素的上游调节,而影响下游的联蛋白1(ANXA1)、核转录因子kB(NFkB)、嗜酸粒细胞趋化蛋白Eotaxin1(CCL11)、IFN-γ、补体C3(C3)、前列腺素内过氧化物酶2(PTGS2)、维连接蛋白1(FN1)以及细胞因子IL-4、IL-5、IL-13;S100A8蛋白受到钙离子(Ca2﹢)、S100A9的调节,能够影响下游Toll样受体4(TLR4)、非受体酪氨酸激酶(TEK)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、心肌素样蛋白2(MKL2)、免疫球蛋白、精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)以及细胞因子IL-4、IL-10、IL-13等;CypA受到过氧化氢(H2O2)、PRDX6、环孢菌素A(CsA)的上游调节,影响了下游基质金属蛋白酶9(MMP9)、NFkB、纤维蛋白原(FNG)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、细胞分裂周期蛋白42(CDC42)、TEK、PRDX6、FN1、Cfl1以及细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-13和趋化因子CCL3(巨噬细胞炎性蛋白1α)、CCL5(受激活调节正常T细胞表达和分泌因子)等。值得注意的是3个蛋白均可以调节多种细胞因子,对CD4产生调控作用,而CD4细胞又是免疫系统中最重要的免疫细胞;此外CypA、CC10蛋白又与T细胞相关趋化因子CCL3、CCL5、CCL11相关,说明针刺抗哮喘效应可能通过针刺抗哮喘差异表达蛋白对CD4分子的调控作用而发挥,它可能是针刺抗哮喘的作用靶点。

图3 基于IPA软件的针刺抗哮喘差异表达蛋白分子调控网络(实线表示直接关系,虚线表示间接关系)

3 讨论

生命科学是21世纪前沿学科,随着人类基因组遗传图、物理图的相继完成,功能基因组和蛋白质组研究成为后基因时期主要研究热点。针灸学是生命科学的分支学科之一,针灸研究也是生命科学研究的一个重要组成部分。利用生命科学的理论、技术与方法来研究针灸效应,可以为针灸作用分子途径和机制研究提供新的线索,更好地阐述针灸效应这一生命活动现象。

蛋白质是机体细胞功能的主要执行者,对大多数蛋白质都是以多个蛋白质相互作用的形式完成不同的细胞功能。针刺抗哮喘差异表达蛋白功能分类显示,CypA、S100A8、S100A9、S100A11、RAGE等差异表达蛋白与机体免疫调节作用密切相关,并与RAGE、Alb、Cf1等蛋白具有直接或间接的相互作用关系,涉及了RhoA信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞IL-2R beta活化通路、嗜酸性粒细胞Ccr3信号通路等生物通路。其中RhoA信号通路与气道炎症、气道高反应性[11]密切相关;Toll样受体信号通路可以激活天然免疫,是诱导T细胞分化的关键因子,能够促进Th0细胞向Th1细胞分化[12];T细胞IL-2R beta的活化能够促进调节性T细胞的分化;嗜酸性粒细胞Ccr3信号通路对Th2型免疫反应嗜酸性粒细胞聚集、脱颗粒具有重要调节作用。这些差异表达蛋白和信号通路的改变,说明针刺刺激机体后能够调节免疫相关蛋白,并通过协同作用将信号传递至胞内,调节免疫、炎症信号通路发挥抗哮喘作用。

哮喘是一种慢性气道炎症性疾病,Th1/Th2和Th17/Treg平衡理论是哮喘发病机制的核心。CD4分子在哮喘气道炎症的发生、发展中起到重要的作用,CD4分子主要表达于辅助T细胞,参与Th细胞TCR识别抗原的信号转导,初始CD4﹢T细胞可分化为Th1、Th2、Th17和Treg4种调节性T细胞亚型,而细胞因子微环境决定了初始CD4﹢T细胞的分化倾向。分子调控网络分析显示CC10、CypA、S100A8等针刺抗哮喘差异表达蛋白可以对下游IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13 和IL-17等细胞因子产生调控作用,并有可能改变Th细胞的外周因子环境,影响初始CD4﹢T细胞的分化,进而发挥免疫调节作用。通过分子调控网络可以发现CD4分子是针刺抗哮喘效应的靶点分子,不仅受到一种差异表达蛋白的影响,多个差异蛋白均参与了这一调节作用,这为针刺的双向免疫调节作用提供了理论依据。

[1] Braman SS. The global burden of asthma[J]. Chest, 2006,130(1S): 4S-12S.

[2] Global Strategy for Asthma Management and Prevention. Global Initiative for Asthma (GINA) 2014. Available from: http://www.ginasthma.org/.

[3] Fung KP, Chow OK, So SY. Attenuation of exercise-induced asthma by acupuncture[J]. Lancet, 1986,2(8521-22):1419-1422.

[4] Choi JY, Jung HY, Kim JI, et al. A randomized pilot study of acupuncture as an adjunct therapy in adult asthmatic patients[J]. J Asthma, 2010,47(7):774-780.

[5] Xu J, Zheng S, Fang W. Role of combining spreading moxibustion and point injection in reducing ECP and LPO levels and improving lung function[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2014, 12(1):12-16.

[6] Yang YQ, Chen HP, Wang Y, et a l. Considerations for use of acupuncture as supplemental therapy for patients with allergic asthma[J]. Clin Rev Allergy Immunol, 2013,44(3):254-261.

[7] Wang Y, Cui JM, Ma SL, et al. Proteomics analysis of component in serum with anti-asthma activity derived from rats treated by acupuncture[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2009,7(6):326-331.

[8] Xu YD, Cui JM, Wang Y, et a l. Proteomic analysis reveals the deregulation of inflammation-related proteins in acupuncture-treated rats with asthma onset[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2012:850512.

[9] Andrieux G, Le Borgne M, Théret N. An integrative modeling framework reveals plasticity of TGF-β signaling[J]. BMC Syst Biol, 2014,(8):30.

[10] Nurnberger JI Jr, Koller DL, Jung J, et al. Identification of pathways for bipolar disorder: a meta-analysis[J]. JAMA Psychiatry, 2014, 71(6):657-664.

[11] Gerthoffer WT, Solway J, Camoretti-Mercado B. Emerging targets for novel therapy of asthma[J]. Curr Opin Pharmacol, 2013,13(3): 324-330.

[12] Iwasaki A, Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses[J]. Nat Immunol, 2004,5(10):987-995.

Bioinformatic Analysis of Differentially Expressed Proteins in Anti-asthma Acupuncture

RAN Jun1, YIN Lei-miao2, WANG Yu2, XU Yu-dong2, LIU Yan-yan2, YANG Yong-qing1. 1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China; 2. Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian,Shanghai 200030,China

ObjectivTo analyze the biological functions and molecular networks of differentially expressed proteins in anti-asthma acupuncture and explore the application of bioinformatic methods to and ideas for acupuncture research. Methods PANTHER classification system, Pathway Interaction Database (PID) and Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software were used for molecular biological function annotation of differentially expressed proteins in anti-asthma acupuncture and analyses of signaling pathways, protein-protein interactions and molecular regulatory networks.ResultsSeveral differentially expressed proteins in anti-asthma acupuncture were closely related to immune system function and involved in biological pathways including RhoA signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway, eosinophils Ccr3 signaling pathway and T cell IL-2R beta activation pathway. They produced an immunoregulatory effect by modulating downstream cytokines and influencing CD4 molecule function).ConclusionsImmune-related molecular pathways and regulation targets involved in the anti-asthma effect of acupuncture are obtained by bioinformatic analysis of differentially expressed proteins in anti-asthma acupuncture, which provides a basis for further research on the immune-related molecular mechanisms of acupuncture treatment for asthma.

Acupuncture; Asthma; Differentially expressed protein; Bioinformatics

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.09.0875

1005-0957(2014)09-0875-04

2014-02-25

国家自然科学基金项目(81173341;81173332;81202753);上海市青年科技启明星计划(12QA1403000);上海市卫生系统优秀青年人才培养计划(XYQ2013081);上海市教委预算内科研项目(2011JW49)

冉君(1984 - ),男,2011级博士生

杨永清(1964 - ),男,博士生导师,E-mail:dryqyang@163.com