电针傍刺对大鼠褥疮炎性细胞的影响

孙忠人,任雪,张秦宏,仇立波,方剑乔

(1.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040;2.浙江中医药大学附属第三医院,杭州 310000)

·动物实验·

电针傍刺对大鼠褥疮炎性细胞的影响

孙忠人1,任雪1,张秦宏1,仇立波1,方剑乔2

(1.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040;2.浙江中医药大学附属第三医院,杭州 310000)

目的观察电针以及普通针刺对褥疮模型大鼠各种炎性细胞(肥大细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞)的影响,探讨电针在褥疮愈合过程中的作用机理。方法选取雄性SD大鼠75只,随机分为模型组、针刺组和电针组,每组25只。造模后模型组每日除进行基础护理外不做其他任何处理;针刺组每日基础护理同时进行针刺治疗;电针组每日基础护理同时先行针刺(同针刺组),随后连接直流电刺激仪进行电刺激治疗。每日治疗1次,直到取材时间点当天结束治疗。每组在治疗后第1、3、7、14、21 d时采用皮肤损伤面积追踪法,观察褥疮损伤面积的愈合情况,并观察不同时间点各种炎性细胞组织切片的组织学、形态学变化,同时各组进行肥大细胞计数。结果与模型组相比,针刺组大鼠在褥疮面积变化方面无显著性差异(P＞0.05);电针组中褥疮面积平均值明显变小,具有显著性差异(P＜0.05),且电针组大鼠在整个炎症反应过程中的各个时间点上,肥大细胞在致密度和脱颗粒程度上明显提前于模型组,中性粒细胞和巨噬细胞聚集出现的时间均早于模型组,随后出现的成纤维细胞聚集现象也提前于模型组。与针刺组相比,电针疗法可以明显降低褥疮面积的平均值,促使肥大细胞脱颗粒提前,具有显著性差异(P＜0.05),并能加速中性粒细胞和巨噬细胞的聚集,使成纤维细胞聚集修复的时间提前。3组内部5个不同时间点比较,①褥疮面积方面,电针组面积平均值在治疗14 d时变化显著,与其余时间点比较具有显著性差异(P＜0.05);模型组和针刺组面积平均值在治疗21 d时变化显著,与其余时间点比较具有显著性差异(P＜0.05);②肥大细胞数目方面,电针组在治疗3 d时达到最高值,与其余时间点比较具有显著性差异(P＜0.05);模型组和针刺组在治疗7 d时达到最高值,与其余时间点比较具有显著性差异(P＜0.05)。结论电针傍刺疗法可以明显减少褥疮的面积,缩短褥疮愈合的时间。电针疗法可通过加速肥大细胞脱颗粒进程来缩短炎症反应启动时间,并能加快巨噬细胞和中性粒细胞的聚集吞噬作用来促进成纤维细胞的聚集修复,迅速促进大鼠褥疮愈合,这可能是电针治疗大鼠褥疮的作用机制之一。

电针;傍刺法;褥疮;炎性细胞

褥疮又名“压疮”、“席疮”、“压迫性溃疡”,其早期的定义为“局部组织持续受压后发生的缺血性坏死”,随着人们对褥疮发生机制的不断研究和临床实践,褥疮的定义也逐渐被更新为“由压力、剪切力或摩擦力导致的皮肤、肌肉或皮下组织的局限性损伤,常发生在骨隆突处”。传统上对于褥疮的治疗多体现在清创、疮面覆盖无菌敷料等措施,被动的等待伤口愈合,但是往往因其疮口迁延不愈或愈合速度较慢,且易引起全身感染,严重者可引发败血症而成为临床上常见的难题。如何缩短治疗时间,提高患者的生存质量,减轻护理人员的负担成为目前临床上亟待解决的问题。本实验通过对褥疮创面愈合的速度及褥疮大鼠的致死率来观察电针傍刺及单纯傍刺在褥疮愈合过程中的作用,评价其疗效,努力为褥疮的愈合提供新的临床治疗思路和手段,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组

健康SD大鼠75只,由黑龙江中医药大学动物实验中心提供,体重250～300 g,在标准实验室条件(12 h光线,12 h明暗周期)下饲养。采用随机数字表法将其随机分为模型组、针刺组和电针组,每组25只。造模前3组每笼饲养5只,造模后均单笼饲养。

1.1.2 实验仪器与试剂

体重秤(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)、KP-21C智能求积仪(heijima,nagaoka-shi,niigata, Japan)、G6805-B电刺激仪(上海欣曼科教设备有限公司)、华佗牌0.25 mm×13 mm针灸针(苏州医疗用品厂有限公司)、真空干燥箱(DZG-6020,上海森信实验仪器有限公司)、超低温冰箱(702 ULT FREEZER,USA)、电热恒温水浴锅(HH Sy21-Ni,北京长风仪器仪表厂)、光学显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备[1]

①采用腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉。取大鼠左侧卧位,在脊柱旁开1 cm处,以右侧肋骨为中心的4 cm×8 cm范围内,进行脱毛处理(电动剃须刀剃除后用中性脱毛膏涂抹,10 min后擦掉脱毛膏,用乙醇和碘伏清洁局部皮肤)。然后在大鼠背部靠头端距正中线1 cm处(约第一肋骨水平)做一深至筋膜、长约3 cm的横向切口。②钝性剥离组织,将皮肤和肌肉分开,剥离范围控制在4 m×3 cm内,将体积为4 cm×2.5 cm ×0.07 cm的钢片植入大鼠右肩部的皮下,所有铁片均高压灭菌并温箱(70℃,2 h)烤干,植入成功后用6-0 Dexon聚羟基乙酸线缝合切口,再用碘伏消毒、青霉素冲洗以防止感染。③术后24 h在钢片植入处的皮肤表面放置磁铁。磁铁磁通量为1250 GS(磁通量的选择是根据诱导溃疡的流体静力压推导出来的,研究表明,当外加压力超过局部毛细血管的压力(12～32 mmHg)时,就可诱导溃疡。而外加压力约为50 mmHg最合适[1]。④开始皮肤缺血-再灌注损伤循环,即外源所压磁铁对皮肤产生压力,造成局部组织缺血,磁铁对皮肤产生压力,造成局部组织缺血,每次缺血2 h后再将外源磁铁取下,让局部血流恢复30 min。如此循环,每日每只大鼠进行5个连续的循环,连续2 d。总计缺血-再灌注10个循环,缺血时间20 h。缺血再灌注过程中大鼠自由进食、饮水,单笼饲养。⑤模型成功标准,以皮肤变黑、糜烂,全层皮肤组织损伤,有坏死组织但深度不明显,作为判断Ⅲ期压疮形成的标准[2]。

1.2.2 实验处理

在开始治疗后的第1、3、7、14、21 d分别将各组5只大鼠麻醉后取出受损伤的皮肤组织。

①模型组,采用单笼饲养,每日除进行基础护理外不做其他任何处理。在规定疗程内每天随同电针组和针刺组一样抓取捆绑1次,捆绑固定时间为30 min,不予针刺治疗,也不通电。②针刺组,采用单笼饲养,每日基础护理同时进行针刺治疗。采用傍刺法,针刺位置位于疮面中央位置,直刺深度0.2寸;同时距离疮面外缘正常皮肤处,平刺深度0.2寸,不通电,留针30 min。每日1次。③电针组,采用单笼饲养,每日基础护理同时先行针刺(同针刺组),随后连接直流电刺激仪进行电刺激治疗,选择电流1 mA,频率为1 HZ,波形为疏密波[3],通电时间为30 min[4]。每日治疗1次,直到取材时间点当天结束治疗。

实验期间各组大鼠均是普通饲料喂养,自由摄食和饮水,每日更换饲料和饮水,勤换垫料,保持大鼠清洁的生存环境。针刺组和电针组治疗的同时,模型组大鼠亦固定于鼠板。

1.2.3 样品的处理及检测方法

分别在治疗开始后第1、3、7、14、21 d,每组5 只,采用硫酸盐薄膜勾勒出损伤组织的周长,并用记号笔作标记。运用Planimter(PLANIX7)求积仪测量损伤区域的面积。为了提高精确度,每处损伤处追踪3次,测量3次,然后求均值。

1.2.4 组织的固定包埋

在治疗后第1、3、7、14、21 d,每组5只,面积测量结束后进行局部组织取材,后经10%甲醛固定24 h,再进入脱水、透明、浸蜡程序后,进行石蜡包埋;切片厚度为4 μm,方向为组织块纵切面;经60℃恒温箱烤片3 h后,再将切片脱蜡、染色、脱水、透明、封固、观察。光镜下观察组织切片的病理学组织形态学变化并随机摄片,观察肥大细胞的切片用甲苯胺蓝染色法进行计数,其他3种炎性细胞运用HE染色法后进行镜下观察。

1.2.5 肥大细胞的染色原理、步骤及计数方法

肥大细胞一般较大,直径约20～30 μm,呈圆形或椭圆形,胞核较小,圆形,胞质内充满粗大并有异染性的圆形嗜碱性颗性,这种颗粒属硫酸酯呈异色性, 在HE染色中不明显,会和其他的细胞质一样被曙红染成红色,故用甲苯胺蓝法将肥大细胞颗粒染成红紫色(即所谓异色性),其他组织蓝色(正色性)。

染色步骤如下,组织切片常规脱蜡至水。入甲苯胺蓝夜30 min。少水洗,洗去多余染液。入冰醋酸液分化,直到胞核和颗粒清晰。稍水洗,用冷风吹干。二甲苯透明,中性树胶封固。

肥大细胞染色以胞质出现紫蓝色颗粒为阳性反应,其计数方法参照Molin[5]法,每例标本随机选择10个高倍视野(HPF,400×),进行观察并计数肥大细胞,然后求出每个标本切片肥大细胞的平均数,以每高倍镜视野中肥大细胞数目加减标准差表示不同类型组织的肥大细胞数目(肥大细胞数目±S/HPF)。

1.2.6 巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞的染色原理及步骤

HE染色法即苏木精-伊红染色法,苏木精染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色,伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色,软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色,黏液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色,胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色,弹力纤维呈亮粉红色,红血球呈橘红色,蛋白性液体呈粉红色。

染色步骤如下,切片以二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水。入苏木素染色5 min。入1%盐酸乙醇溶液分化5 s。入自来水蓝化30 min。入1%伊红染夜1 min。逐级乙醇脱水(70%,80%,95%Ⅰ,95%Ⅱ,100%Ⅰ,100%Ⅱ)。二甲苯透明(二甲苯Ⅰ5 min,二甲苯Ⅱ5 min)。中性树胶封片。

1.2.7 统计学方法

采用SPSS17.0进行统计学分析,对计量资料先行方差齐性分析后,组间比较运用单因素方差分析,并进行多重比较,计量结果以均数±标准差表示。

2 结果

2.1 电针傍刺对大鼠褥疮面积的影响

由表1可见,电针组分别与模型组和针刺组相比,电针疗法可以明显降低大鼠褥疮的面积,提高褥疮的愈合质量,具有显著性差异(P＜0.05);针刺组与模型组相比,针刺组在褥疮愈合面积方面的差异不具有统计学意义(P＞0.05)。

表1 电针傍刺对大鼠褥疮面积平均值的影响(±s,mm2)

表1 电针傍刺对大鼠褥疮面积平均值的影响(±s,mm2)

注:与模型组比较1)P＜0.05;与针刺组比较2)P＜0.05

组别 n 面积电针组 25 314.61±102.611)2)针刺组 25 421.33±140.60模型组 25 454.11±174.72

由表1、2可见,3组在褥疮面积比较方面,电针组面积平均值在治疗14 d时变化显著,与其他4个时间点比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01),其余4个时间点之间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);模型组和针刺组面积平均值在治疗21 d时变化显著,与其他4个时间点比较,差异均有统计学意义(P＜0.01),其余4个时间点之间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各组大鼠褥疮面积在5个不同时相的比较 (±s,mm2)

表2 各组大鼠褥疮面积在5个不同时相的比较 (±s,mm2)

注:与同组7 d比较1)P＜0.01;与同组14 d比较2)P＜0.01,3)P＜0.01

组别 n 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d模型组 25 528.53±101.41496.46±111.32457.32±147.27331.28±60.17 71.97±33.832)针刺组 25 531.39±119.39512.18±149.18429.37±120.82328.76±53.49 69.34±42.893)电针组 25 517.20±107.48485.46±136.26387.36±102.45 115.51±40.291)47.24±20.52

2.2 肥大细胞计数及结构形态的变化

采用甲苯胺蓝法显示肥大细胞,可见肥大细胞体积较大,胞质内有紫兰色颗粒,通过对比三组在5个时间点下的组织形态学变化发现,模型组在治疗的第1 d时均在炎症中心皮下结缔组织内可见成簇或成串的肥大细胞分布,细胞形态多样,呈圆形、椭圆形,无突起,胞浆染为蓝紫色,胞膜清晰完整,胞质均匀,内有致密深蓝色颗粒;在第3、7 d时炎症病灶局部组织表皮呈隆起的波浪状,真皮层增厚,皮下结缔组织有大量肥大细胞聚集并向真皮层延伸,胞浆染为深蓝色,大部分肥大细胞可见脱颗粒现象,胞膜破溃,颗粒漏出胞膜遍布于组织间隙,细胞形态不规则,轮廓模糊;在第14 d镜下可见肥大细胞数量明显减少,脱颗粒现象不明显,提示肥大细胞进入凋亡状态;第21 d时可见病灶局部皮下结缔组织有散在肥大细胞,染色较浅,几乎没有脱颗粒现象,提示褥疮已经进入恢复期。与模型组相比较,电针组大鼠在整个炎症反应过程中的各个时间点上,肥大细胞在致密度和脱颗粒程度上明显提前于模型组,针刺组次之,如在治疗第1 d和第3 d时,电针组中肥大细胞的脱颗粒现象最为明显,局部炎症反应也比较清晰,而在治疗第7 d时,电针组中镜下情况类似于空白组14 d时,而在其治疗的第14 d时仅能观察到少数的肥大细胞,说明炎症已经在恢复期。

表3 各组大鼠褥疮局部肥大细胞数在5个不同时相的比较 (±s)

表3 各组大鼠褥疮局部肥大细胞数在5个不同时相的比较 (±s)

注:与同组治疗3 d比较1)P＜0.05;与同组治疗7 d比较2)P＜0.05

组别 n 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d模型组 25 14.30±3.46 18.76±3.32 20.35±3.14 11.28±3.432)11.97±3.832)针刺组 25 14.39±2.39 17.18±2.18 21.24±2.06 12.76±2.422)9.84±1.652)电针组 25 18.32±1.35 21.48±1.27 12.70±1.481)9.33±2.801)5.27±1.721)

由表3可见,电针组在治疗3 d时肥大细胞数目达到最高值,与同组治疗7、14、21 d相比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05);空白组和针刺组在治疗7 d时肥大细胞数目达到最高值,与同组治疗14、21 d相比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05),说明电针组大鼠在整个炎症反应过程中能促使肥大细胞脱颗粒提前,在各个时间点上肥大细胞致密度和脱颗粒程度明显提前于模型组和针刺组。

2.3 巨噬细胞、中性粒细胞的组织形态学变化

电针组在治疗第1 d时可见组织周围间质有巨噬细胞、中性粒细胞聚集,即炎性细胞浸润现象,巨噬细胞一般体积较大,为圆形或椭圆形,染色较深,核内的结构看不清;中性粒细胞呈圆形,胞质中含有大量的细小颗粒,提示局部创面有炎症反应;在第3 d时炎症病灶周围的巨噬细胞和中性粒细胞聚集程度达到最高峰,皮下结缔组织中有大量巨噬细胞、中性粒细胞聚集并向真皮层延伸,细胞形态不规则,轮廓模糊,内含有许多颗粒或空泡;在第7 d镜下可见巨噬细胞、中性粒细胞数量明显减少;第14 d时可见病灶局部皮下巨噬细胞几乎消失,染色较浅。

模型组和针刺组在治疗第1、3、7 d时间段中,巨噬细胞和中性粒细胞聚集程度逐渐增加,第7 d时巨噬细胞浸润现象最为明显,局部炎症反应也比较清晰,而在治疗第14 d时镜下情况类似于电针组第7 d时,而治疗第21 d时能观察到少数的巨噬细胞,说明巨噬细胞已进入凋亡期。

2.4 成纤维细胞的组织形态学变化

成纤维细胞较大,轮廓清楚,多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构,其细胞核呈规则的卵圆形,核仁大而明显。电针组在治疗第1、3、7 d时间段中成纤维细胞逐渐增多,在治疗第7 d时镜下成纤维细胞数量显著增加,聚集程度达到最大;在治疗第14、21 d时间段可见病灶局部皮下中炎性细胞几乎消失,染色较浅,成纤维细胞聚集程度逐渐降低。模型组和针刺组在治疗第1、3、7、14 d时间段中成纤维细胞逐渐增多,在治疗第14 d时镜下成纤维细胞数量显著增加,聚集程度达到最大;在治疗第21 d时可见病灶局部皮下中炎性细胞几乎消失,染色较浅,成纤维细胞聚集程度降低。

3 讨论

近年来,国内对褥疮早期的研究仅局限于药物治疗,包括中药治疗和西药治疗两大方面。西药主要外用抗生素或激素治疗,其不足之处在于很多患者对这些药物过敏或易产生耐药性。中医学则认为褥疮由于一般病史都较长,全身进行性营养消耗较明显,辨证总体以气血虚弱为主。通过大量文献观察发现中药治疗多以外用为主,或结合西药外敷治疗。在国内有关针刺治疗本病的相关研究很少,多倾向于艾灸或火针疗法的研究,如张会珍等[6]、史礼[7]运用艾灸配合皮肤针疮周叩刺治疗褥疮,结果治愈率达到92.2%;李德君[8]在传统治疗方法基础上局部激光照射的同时整体上辅以针灸辨证加减治疗,发挥针灸调和阴阳、疏通经络的作用,治愈率达到93%;吴峻等[9]、阎翠兰等[10]从最初在运用火针治疗慢性软组织损伤中发现火针疗法可以促进炎症及坏死组织的再吸收。与此同时,还做了有关火针治疗褥疮的临床疗效观察并证明火针可以提高临床褥疮的治愈率并且可以缩短治疗时间[11]。

炎性细胞在组织损伤修复中有不可忽视的作用,如肥大细胞可释放炎性介质参与机体内多种生物功能活动。在肥大细胞的研究中发现炎症产生的关键在于肥大细胞脱颗粒产生的多种炎性介质参与了炎症反应。肥大细胞不仅是炎症发生的主要启动因子,而且其释放的生物因子更能促进炎症进一步加重。肥大细胞与针效的产生有密切关系,而细胞脱颗粒的百分率反映了炎症反应的程度。电针在褥疮修复过程中的机制可能在于针刺可以更快地激活肥大细胞,引起并加快局部炎症病灶一系列血管和免疫反应,最终达到抗炎的目的。如果说肥大细胞参与了炎症反应的启动,那么巨噬细胞和中性粒细胞则负责清除“垃圾”,尤其是巨噬细胞作为体内的“清道夫”,它们会以固定细胞或游离细胞的形式消灭侵入机体的细菌、吞噬异物颗粒,参与和促进炎症反应并启动机体免疫反应。在机体创伤修复过程中,巨噬细胞分泌的多种生物活性物质可以直接引导着机体修复的整个进程。中性粒细胞具有活跃的变形运动和吞噬功能,起重要的防御作用。其吞噬对象以细菌为主,也吞噬异物。中性粒细胞具有很强的趋化作用,当炎症发生时,它们被趋化性物质吸引到炎症部位。成纤维细胞具多样性,可以缓慢地迁移。在伤口愈合过程中,成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖,与新生毛细血管共同形成肉芽组织,填补伤口组织缺损。创伤修复是一个在时间和空间上都受到一定的细胞因子所调控的复杂生物学过程,炎性细胞的活动情况能从根本上影响创面的愈合时间,细胞因子能诱导中性粒细胞和巨噬细胞向创伤部位补充(即趋化作用),并能促进成纤维细胞增殖和细胞基质的合成,促进表皮细胞的增殖。

综上所述,目前国内有关针刺治疗褥疮的相关研究较少,电针治疗方面更是空白。在国外,电刺激治疗皮肤损伤方面颇有成效,有学者反复验证了电刺激治疗皮肤溃疡的疗效,随之出现了许多成功的相关研究成果,近年来电刺激疗法已经获得美国医疗保险和公共医疗补助服务中心的认可[12],并且可以用来治疗很多皮肤损伤疾病。采用傍刺手法治疗褥疮的机制在于,皮肤在损伤后,在损伤表面会形成损伤电流[13-16],并且这种损伤电流在损伤组织愈合过程中有很重要的作用,通过施加电刺激这种外源性电流可以促进内皮细胞的迁移、上皮细胞的再生等。本实验通过电针后观察局部损伤组织炎性细胞出现及消失的时间和聚集程度来间接证实了这种说法。

3.1 肥大细胞观察结果讨论

本实验研究发现,电针组、针刺组和模型组的肥大细胞数目在炎症过程中均是先逐渐增多后逐渐减少呈曲线变化,均出现过峰值。电针组在治疗1 d到3 d时段肥大细胞数目迅速增多,其脱颗粒现象最为明显,局部炎症反应也比较清晰,在3 d时达到最高值,后随着治疗时间的延长,肥大细胞数目逐渐降低,说明电针组在治疗开始阶段即启动了炎性反应,在治疗7、14、21 d时间段上肥大细胞数目迅速减少,在治疗第7 d 时,电针组中镜下可见肥大细胞数量明显减少,脱颗粒现象不明显,提示肥大细胞进入凋亡状态,而在其治疗的第14 d时仅能观察到少数的肥大细胞,说明炎症正处于恢复期。模型组和针刺组在治疗1、3、7 d的这一个时间段上肥大细胞数目逐渐增多,在第3、7 d时皮下结缔组织有大量肥大细胞聚集并向真皮层延伸,胞浆染为深蓝色,大部分肥大细胞可见脱颗粒现象,胞膜破溃,颗粒漏出胞膜遍布于组织间隙,细胞形态不规则,并在治疗7 d时达到最高值,而在随后14 d和21 d两个时间段上肥大细胞数目逐渐减少,脱颗粒现象不明显,提示肥大细胞进入凋亡状态,而在其治疗的第21 d时仅能观察到少数的肥大细胞,几乎没有脱颗粒现象,提示模型组和针刺组的脱颗粒现象峰值出现时间落后于电针组。以上结果表明模型组和针刺组炎性反应的启动时间落后于电针组,电针组大鼠在整个炎症反应过程中能促使肥大细胞脱颗粒现象提前,在各个时间点上肥大细胞致密度和脱颗粒程度明显提前于模型组和针刺组。由此推测电针傍刺疗法是通过提前启动肥大细胞,缩短启动炎性反应的时间,加速肥大细胞脱颗粒进程来加速褥疮炎性反应的发生和修复过程,减少大鼠皮肤褥疮的面积,缩短褥疮愈合的时间。

3.2 巨噬细胞、中性粒细胞观察结果讨论

电针组在治疗第1 d时可见组织周围间质有巨噬细胞、中性粒细胞聚集,即炎性细胞浸润现象,巨噬细胞一般体积较大,为圆形或椭圆形,染色较深,核内的结构看不清;中性粒细胞呈圆形,胞质中含有大量的细小颗粒,提示局部创面有炎症反应;在第3 d时炎症病灶周围的巨噬细胞和中性粒细胞聚集程度达到最高峰,皮下结缔组织中有大量巨噬细胞、中性粒细胞聚集并向真皮层延伸,细胞形态不规则,轮廓模糊,内含有许多颗粒或空泡;在第7 d镜下可见巨噬细胞、中性粒细胞数量明显减少;第14 d时可见病灶局部皮下巨噬细胞几乎消失,染色较浅。与模型组相比,电针组大鼠在整个炎症反应过程中的各个时间点上,巨噬细胞和中性粒细胞在聚集时间、聚集程度上明显提前于模型组,针刺组次之,如模型组和针刺组在治疗第1、3、7 d时间段中,巨噬细胞和中性粒细胞聚集程度逐渐增加, 第7 d时巨噬细胞浸润现象最为明显,局部炎症反应也比较清晰,而在治疗第14 d时镜下情况类似于电针组第7 d时,治疗第21 d时能观察到少数的巨噬细胞,说明巨噬细胞已进入凋亡期。以上结果表明电针组在各个时间段上巨噬细胞、中性粒细胞的聚集及凋亡程度早于模型组和针刺组。由此可推测电针傍刺疗法是通过加快巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬作用,使炎症反应的高峰期提前,以此来加速褥疮炎性反应的发生和修复过程。

3.3 成纤维细胞观察结果讨论

电针组在治疗第1、3、7 d时间段中成纤维细胞逐渐增多,细胞较大,轮廓清楚,细胞核呈规则的卵圆形,核仁大而明显,在治疗第7 d时镜下成纤维细胞数量显著增加,聚集程度达到最大,提示褥疮疮面进入修复期;在治疗第14、21 d时间段可见病灶局部皮下中炎性细胞几乎消失,染色较浅,成纤维细胞聚集程度逐渐降低,说明成纤维细胞在逐渐完成组织修复。模型组和针刺组在治疗第1、3、7、14 d时间段中成纤维细胞逐渐增多,在治疗第14 d时镜下成纤维细胞数量显著增加,聚集程度达到最大;在治疗第21 d时可见病灶局部皮下中炎性细胞几乎消失,染色较浅,成纤维细胞聚集程度降低,说明模型组和针刺组在组织修复过程中成纤维细胞的聚集时间明显晚于电针组。以上结果表明,与模型组相比,电针组大鼠在整个炎症反应过程中的各个时间点上,成纤维细胞在聚集时间、聚集程度上明显提前于模型组。由此可以推测电针傍刺疗法是通过加速成纤维细胞的聚集修复来加速褥疮炎性反应的修复过程。

综上所述,本实验中褥疮模型的选择充分考虑压力与摩擦力在褥疮形成中的作用,使其更接近于临床。实验中电针傍刺疗法能更快激活肥大细胞,引起并加快炎性反应,并能加速肥大细胞的凋亡过程,同时电刺激疗法能加速中性粒细胞和巨噬细胞的聚集吞噬,并使成纤维细胞聚集修复的时间提前,最终能有效缩短炎性反应治愈时间,更早结束炎性反应过程,加快疮口愈合。由此可以推测电针傍刺疗法治疗大鼠皮肤褥疮的主要机理可能是通过加速肥大细胞脱颗粒进程,缩短炎性反应启动时间,加快巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬作用,加快成纤维细胞的聚集修复来加速褥疮炎性反应发生和修复,降低大鼠褥疮的面积,缩短褥疮愈合的时间。肥大细胞脱颗粒后释放的化学物质是穴位局部产生炎性反应的基础。本实验表明炎症反应终止的原因取决于结缔组织中的巨噬细胞和中性粒细胞对肥大细胞颗粒的吞噬作用。而创伤修复是一个在时间和空间上都受到一定细胞因子调控的复杂生物学过程,炎性细胞的活动情况能从根本上影响疮面的愈合时间。电针治疗褥疮的疗效应该是多方面、多角度的,本实验只是初步从炎性细胞组织形态学变化方面来提示电针治疗大鼠褥疮的机理,更深层次的分子生物学机制还有待进一步的研究探讨。

值得强调的是,电针治疗褥疮的疗效应该是多方面、多角度的,本实验只是初步从愈合面积及炎性细胞两个方面来提示电针治疗大鼠皮肤褥疮的疗效,更深层次的效果以及机制还有待进一步的研究探讨。

综上所述,电针傍刺疗法可以明显减少褥疮的面积,缩短褥疮愈合的时间。电针疗法可通过加速肥大细胞脱颗粒进程来缩短炎症反应启动时间,并能加快巨噬细胞和中性粒细胞的聚集吞噬作用来促进成纤维细胞的聚集修复,迅速促进大鼠褥疮愈合,这可能是电针治疗大鼠褥疮的作用机制之一。

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Experimental Study of the Effect of Proximate Needling Electroacupuncture on Inflammatory Cells in Rat Bedsore

SUN Zhong-ren1, REN Xu e1, ZHANG Qin-hong1, QIU Li-po1, FANG Jian-q iao2. 1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China; 2.Zhejiang College of Traditional Chinese Medicine Third Hospital,Hangzhou 310000,China

ObjectivTo investigate the effects of electroacupuncture and conventional acupuncture on inflammatory cells in rat bedsore and explore the mechanism of electroacupuncture action in bedsore healing.MethodsSeventy-five male SD rats were randomly allocated to model, acupuncture and electroacupuncture groups, 25 rats each. after model making, the model group received daily basic nursing alone; the acupuncture group, acupuncture treatment in addition to daily basic nursing; the electroacupuncture group, acupuncture (same as in the acupuncture group) followed by electrostimulation with a direct current stimulator in addition to daily basic nursing. Treatment was given once daily until the day of sampling time point. In every group, the bedsore healing area was observed using the skin lesion area tracing method at 1, 3, 7, 14 and 21 days after treatment. Histological and morphological changes on the section of tissue with various inflammatory cells were also observed at different time points. Mast cells were counted at the same time.ResultsCompared with the control group, the bedsore healing area did not change significantly in the conventional acupuncture group (P＞0.05) and its mean value decreased significantly in the electroacupuncture group (P＜0.05); mast cell density and degranulation, neutrophil and macrophage congregation, and subsequent fibroblast congregation occurred earlier in the electroacupuncture group. Compared with the acupuncture group, the mean value of bedsore healing area decreased significantly, mast cell degranulation occurred significantly earlier (P＜0.05), neutrophil and macrophage congregation was accelerated and fibroblasts congregated and were repaired earlier in the electroacupuncture group. A comparison between five different time points in the three groups showed 1) the mean value of bedsore healing area changed significantly at 14 days after treatment compared with the other time points in the electroacupuncture group (P＜0.05) and changed significantly at 21 days after treatment compared with the other time points in the model and acupuncture groups (P＜0.05); 2) the number of mast cells reached the maximum value at 3 days after treatment, being significantly different from those at the other time points in the electroacupuncture group (P＜0.05) and reached the maximum value at 7 days after treatment, being significantly different from those at the other time points in the model and acupuncture groups (P＜0.05). Conclusion Proximate needling electroacupuncture can markedly decrease the bedsore area and shorten bedsore healing time. Electroacupuncturecan shorten Inflammatory reaction starting time by accelerating mast cell degranulation and quicken macrophage and neutrophil congregation and phagocytosis to promote fibroblast congregation and repair and to speed rat bedsore healing. That may be one of the mechanisms of therapeutic action of electroacupuncture on rat bedsore.

Electroacupuncture; Proximate needling; Bedsore; Inflammatory cell

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.09.0862

1005-0957(2014)09-0862-06

2014-02-12

浙江省“重中之重”学科(针灸推拿学)开放基金(ZTK2010A08);黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12511508,12521Z023);黑龙江中医药大学校科研基金(201106)

孙忠人(1960 - ),男,教授

方剑乔(1961 - ),男,教授,E-mail:fangjianqiao7532@163. com