腐植酸产品特性及其对真菌和植物生长的影响

Muhammad Yaqub Asif Naeem 著

董心亮2 管天玉2 林启美2* 译

(1 巴基斯坦农业与生物核能研究所 费萨拉巴德 009241 2 中国农业大学资源与环境学院 北京 100193)

贫瘠土壤可以通过施用化肥或有机肥来提高土壤肥力。土壤微生物尤其是真菌，通过有机物的分解和转化，可以释放出植物必需的营养物质。因此，真菌在改善土壤肥力，提高土壤生产力过程中起到重要作用。在微生物降解产物中，腐殖物质极其重要。腐殖物质具有多种功能，如保持与提高土壤肥力，促进土壤生物和植物生长等。大量研究证实，有机质特别是腐殖物质，对土壤—植物系统具有有益作用。

腐殖物质或腐植酸盐是微生物合成的物质。但是，埋在深层土壤下的植物，经过数百万年的物理化学变化，也可形成腐殖物质，如世界各地丰富的褐煤。在巴基斯坦的塔尔地区，褐煤储量超过1700亿吨。在过去的几十年里，这些地区的天然腐植酸资源被大量开发，并广泛应用在农业生产中，目前市场上有许多腐植酸产品，如纯腐植酸盐及其衍生物等。然而，由于形成腐殖质的植物种类繁多，致使腐植酸的化学和物理性质差异很大。因此，评价不同腐植酸产品在农业应用上的效果是非常必要的。目前应用评价腐植酸产品的方法很多，其中，较为常用的方法之一就是比较腐植酸在改善微生物生长、繁殖、提高微生物活性以及促进土壤和堆肥过程中有机物质分解与转化等方面的作用。但这种方法并不完善，还有待进一步研究。

巴基斯坦地区土壤有机质含量非常低，有机碳含量0.52%～1.38%。其中，大部分土壤有机碳含量低于1%，且10%为碱溶性的腐殖质。其土壤有机质含量低的主要原因：一是低投入，二是有机物分解较快，这主要是由耕作制度引起的，如水稻—小麦轮作。目前主要采用补充营养的方法来提高土壤肥力，如种植绿肥可提高土壤有机质含量，增强土壤生物活性，施用厩肥也可达到此目的。对于花卉，一般都通过施用有机肥料以提高和维持土壤肥力及生物活性。有机肥料大多是农家肥，或绿叶植物残体经过8～12周堆制自然腐熟而成，质量一般较好，通过人为接种微生物等措施，可将堆肥时间缩短到两周，也可采取其他措施，加快微生物生长繁殖，进一步改进堆制工艺。但是，人们几乎忽略了腐植酸的作用。腐植酸对微生物尤其是真菌的生长有显著的影响，而真菌在有机质分解和腐质化过程中起主要作用。一些研究结果表明，腐殖物质能够促进多种有益微生物生长和繁殖。Chen和Wang提出，腐殖物质络合微量元素(如铁)，提高其移动性，可到达微生物细胞表面，有助于微生物吸收利用。

根据市场上销售的腐植酸肥料情况，本研究比较了4种不同厂商生产的腐植酸肥料的理化性质(如pH值、电导率、水溶性、密度)，光学性质(消光系数)，碳和氮含量，对4种真菌生长的影响，以及对小麦、玉米、绿豆和田菁属种子萌发和幼苗生长的影响。

1 材料与方法

1.1 腐植酸含量和光学性质

市场销售的腐植酸大多是经过碱处理的褐煤，含有腐植酸和黄腐酸。从市场购买的4种腐植酸肥料样品编号为：A、B、C和D。量取50 mL腐植酸肥料称重，计算其密度。

相对溶解度测定：称取10 g样品3份，溶于500 mL去离子水中，旋转振荡 60 min后，室温下4000 rpm/min离心30 min，用50 mL去离子水洗涤残渣2次。收集洗涤液，测定洗涤液和原液的pH值和电导率。

腐植酸光学性质、碳和氮含量测定：向2%腐植酸肥料溶液加入0.1 mol/L NaOH溶液，旋转振荡1 h后，室温下4000 rpm/min离心30 min。取上清液，用浓硫酸调节pH值至1.5～2.0，在90 ℃下恒温30 min，冷却至室温后，离心，得到残渣，即腐植酸馏分。将所得的腐植酸馏分再次用0.1 mol/L NaOH溶解，吸取一定量腐植酸溶液和离心前的上清液，分别采用消化—比色法和微量凯氏法测定碳含量和氮含量。腐植酸溶液稀释50倍后，分别在400 nm、465 nm、500 nm、600 nm、665 nm和700 nm下比色，计算消光系数(E465/E665)。

1.2 腐植酸对真菌菌落生长的影响

从堆肥中分离出4种真菌Alternaria alternnata，A.citri，Trichoderma harzianum 和T.hamatum，在麦芽琼脂培养基中培养，保存备用。为了进一步研究腐植酸对菌落生长的影响，将真菌接种在麦芽琼脂平板上，然后从菌落生长活跃的地方，切下一个直径5 mm的圆盘作为接种材料。向麦芽琼脂培养基内加入系列腐植酸肥A，其含量分别为0.015%，0.025%，0.04%和0.05%，腐植酸肥A是培养基中唯一的碳源。将培养基的pH值调至5.6，此时腐植酸肥A的活性最高。先将培养基倒入培养皿，然后把切下的接种材料放在培养基上，30 ℃恒温条件下培养7天后，测量菌落直径。

1.3 腐植酸对植物种子萌发和幼苗生长的影响

称取200 g酸洗砂于培养皿中(Φ10 cm)，分别将其加入到0，0.015%，0.025%和0.035%的4种腐植酸肥料溶液中(加入酸洗砂之前，用稀硫酸调节pH至7)，调节湿度至25%。每个培养皿分别放入10粒小麦(栽培品种Sehr)、绿豆(绿豆-54)、玉米(C-12)和田菁种子，每个处理3次重复。记录种子萌发率，10天后测定根长、芽长及芽干物质含量。

1.4 统计分析

使用MSTAT软件对数据进行方差分析，均值进行Duncan多重比较，显著性水平为P=0.05。

2 结果与讨论

4种腐植酸肥料性状有显著性差异，见表1。腐植酸肥的外观多样，从细晶体状到稠膏状各不相同，见图1。含水量从52%～71.1%不等，其中，由于腐植酸肥C为稠膏状，因此含水量最高。4中腐植酸肥料的溶解度为30%～98%不等，水溶液颜色也有差异，从浅褐色到中褐色(表1、图2)。大多外销或进口的腐植酸肥称其溶解度达到100%，实际上未必。巴基斯坦并没有腐植酸肥质量控制措施，一般是用8%～10%的NaOH或KOH处理褐煤，混合物烘干、包装即为腐植酸肥料，因此，这些产品含有不同比例的矿物质，而这些矿物质大多没有很好地去除。腐植酸肥料密度(1.67～4.17 g/cm3)差异很大，这可能是由于原料矿物质含量差异所致，例如不同地区的褐煤，矿物质含量有很大差异。

表1 腐植酸A，B，C，D的物理化学特征Tab.1 Some physico-chemical characteristics of humates A, B, C, and D

图1 不同腐植酸肥料的外观Fig.1 Physical appearance of different humates

图2 不同腐植酸肥2%水溶液的颜色变化Fig.2 Color variation of 2% aqueous solution of different humates

4种腐植酸肥料的pH值范围在5.39～10.11之间，电导率变化范围在1.14～3.14 mS/cm之间(表1)。很显然，4种腐植酸肥差异很大，腐植酸肥A的物理化学性质(溶解度、pH、EC和HA-C)好于其他3种肥料，其溶液的pH更接近中性，因此，选取腐植酸肥A来研究其对真菌生长的影响。

4种腐植酸肥料碳含量在22.95%～36.56%之间波动，而氮含量在0.658%～1.183%之间波动，碳氮比(C/N)在30.90～44.14波动，腐植酸肥D的氮含量最低，见表2。上述结果与大多数研究者报道的结果不一致，Campitelli等和Fasurova等报道，腐植酸碳含量约为50%，而氮含量则大于3%，C/N在10～15之间；Kučerik等报道来源于褐煤的9种腐植酸肥，碳含量约57%，氮含量1.3%左右，C/N约为40；2003年，Kučerik和Klucakova等研究发现，大多数生产腐植酸肥料使用原料为褐煤，其碳、氮含量分别为73%和1%。

将4种腐植酸肥样品溶于0.1 mol/L的NaOH溶液中，分离得到腐植酸(HA)和黄腐酸(FA)，腐植酸中碳含量(HA-C)占总碳含量的40.3%～77.5%，黄腐酸碳(FA-C)占总碳含量的22.5%～59.7%，HA-C/FA-C比值为0.68～3.45(表2)。腐植酸肥A的HA/FA比值最高，而腐植酸肥C的HA/FA比值最低。这与Fasurova和Pospisilova报道的HA/FA比值为0.5～3.0基本相一致，他们在后来的研究中还发现，HA/FA比值越高，表示其腐殖化程度越高。本试验选用的4种腐植酸肥中，腐植酸肥C的HA/FA最低，表明其腐殖化程度最低，也是最年轻的褐煤。

表2 腐植酸碳和氮含量分析Tab.2 Carbon and Nitrogen analysis of humates

光学密度可以用来区分腐植酸肥样品中的腐植酸和黄腐酸。未知样品，如褐煤、泥炭、有机土壤等，可以通过测定吸光度和E4/E6值，与标准样品进行比较，从而鉴别腐植酸和黄腐酸含量。E4/E6值与腐植酸平均分子量呈负相关，黄腐酸E4/E6值(>8)远大于腐植酸E4/E6值(3～5)，任何腐植酸样品的E4/E6值可以作为一个很好的生物活性指标。

图3结果表明，在400 nm～700 nm范围内，0.1 mol/L NaOH腐植酸溶液的吸光度，仅有腐植酸肥C变化不大，其余3种腐植酸肥的变化接近，都是随着波长的增加而降低。Kučerik和Klucakova以及Fasurova和Pospisilova的报道中也得到了相似的结果。

腐植酸的消光系数E4/E6(也称为腐殖化指数)为3.64～5.48，见图4。腐植酸肥C的E4/E6最小，为3.64，而腐植酸肥B的E4/E6最大，为5.48。其他波长计算的比值与E4/E6比值趋势相似，相关系数大于0.92。2003年，Kučerik和Klucakova等报道该值为3.9，与本研究的结果相近，但2006年Campitelli等从3种土壤中提取的腐植酸的E4/E6平均值为5.1，Fasurova和Pospisilova报道的E4/E6值则为5.2～9.1，很显然，这与腐植酸的相对腐殖质化程度有关，E4/E6值越高，腐殖化程度越低。

关于Alternaria sp.和Trichoderma harzianum sp.降解纤维素能力的报道很多，其在堆肥过程中具有十分重要的作用。

图3 0.1 mol/L NaOH溶解的腐植酸在400 nm、500 nm、600 nm和700 nm下的吸光度Fig.3 Optical density of humic acid dissolved in 0.1 N NaOH at 400 nm, 500 nm, 600 nm and 700 nm

图4 400nm、500 nm、600 nm和700 nm波长下的消光系数Fig.4 Extinction ratios for wavelength 400 nm, 500 nm,600 nm and 700 nm

本试验4个供试真菌中，Trichoderma harzianum, Alternaria alternata和A.citrae在0.025%的腐植酸培养基生长最快，菌落直径如图5和图6所示。高浓度腐植酸会抑制菌落生长，但0.05%的腐植酸会促进T.hamatum的生长。此外，2010年，Prakash等研究发现了一个有趣的现象，木霉属的真菌如T.viridae既可溶解褐煤，又可释放腐殖物质。大量研究表明，在培养基中添加适宜浓度的腐植酸，可促使微生物生长更快。Gryndler等也证实了腐植酸能够刺激真菌(如菌根)生长。本研究发现，0.2%腐植酸溶液能够促进菌落生长，而Prakash等的研究发现，大于0.5%则会抑制菌落生长。

图5 4种真菌在添加0.00, 0.015%, 0.025%,0.040% 和0.050%腐植酸A的琼脂培养基上的菌落直径Fig.5 Colony diameter of four fungi grown on agar medium supplemented with 0.00, 0.015%, 0.025%, 0.040% and 0.050 % humic Acid “A”

图6 4种真菌在添加不同浓度(0.00，0.015%，0.025%，0.040%和0.050%，分别用C0-C4表示)腐植酸A的培养基中菌落生长情况Fig.6 Colony growth of different fungi on growth medium supplemented with 0.00, 0.015%, 0.025%, 0.040% and 0.050% of humate “A” (C0 - C4, respectively)

不同植物对腐植酸的响应存在差异。以小麦、玉米、绿豆、田菁4种植物为例，腐植酸仅提高了田菁种子萌发率(与对照相比，提高了4.71%～16.7%)，而不同浓度腐植酸对于根和芽生长的影响没有特定的规律,见表3。小麦和玉米的根和芽最长，田菁的根和芽则最小，而小麦的根重最重。腐植酸促使小麦和玉米的根长和芽的干物质重量明显增加，但对绿豆和田菁无显著影响。这与一些报道结果不一致，如施用腐植酸肥可以提高种子萌发率，增强幼苗活力，大幅度提高植物生产力等。研究表明，在根培养基中加入腐植酸，可以提高种子萌发率和幼苗活力，但在以莴苣和番茄为材料进行试验时，腐植酸没有提高这两种植物种子萌发率，仅对提高幼苗活力具有促进作用。分析产生这些差异的原因，可能是由于腐植酸肥的原料及化学组成不同所致。很显然，巴基斯坦销售的腐植酸肥，由于在生产中缺乏适当的质量管理，可能导致了不可预知的结果。

表3 培养基中添加不同的腐植酸肥对4种植物种子萌发和生长情况的影响Tab.3 Seed germination and seedling growth in wheat, maize, mung bean and sesbania as affected by supplementation of growth medium with humates

3 结论

综上所述，市场上销售的腐植酸肥料在很多方面差异显著，包括对微生物和植物的影响。因此，希望有关部门加大对腐植酸肥料质量的监控，这样才能更好地发挥腐植酸在农业上的重要作用，有利于促进巴基斯坦腐植酸肥料行业的可持续发展。很显然，在腐植酸肥料产品上仅标明腐植酸含量远远不够，还需要给出更详尽的参数，包括标记巴基斯坦不同地区的褐煤来源。

略)

译自：Soil Environment,2013,32(1):63～70。