双酶耦合法生产鸟氨酸盐酸盐的工艺改进探讨
2014-06-01
(宁波市镇海海德生化科技有限公司,浙江 宁波 315204)
双酶耦合法生产鸟氨酸盐酸盐的工艺改进探讨
王 雷
(宁波市镇海海德生化科技有限公司,浙江 宁波 315204)
本研究以L-精氨酸为原料制备L-鸟氨酸盐酸盐,通过设计正交实验,讨论反应pH、温度、时间等因素对产率的影响,确定各步反应中较佳的实验条件。得到双酶耦合法制备L-鸟氨酸盐酸盐的较佳工艺条件为:反应pH值9.3,反应的温度为38.5℃,反应时间15小时,产率为83.5%。
鸟氨酸盐酸盐;双酶耦合法;工艺改进;精氨酸
L-鸟氨酸是氨基酸中的一种,是在精氨酸(arginine)产生尿素时的新陈代谢过程产生,但由于L-鸟氨酸不容易从溶液中结晶和提取,因此工业中多以生产L-鸟氨酸盐酸盐(L-Orn HCl)为主,该物质是重要的医药中间体和营养补充剂,主要用于治疗肝硬化疾病的恢复以及增强体能。
本文研究了双酶耦合法制备L-Orn HCl的工艺条件,寻找精氨酸酶(Arginase)和尿酶(Urease)的催化合成L-Orn Hcl最佳工艺参数。对所制备的目标产物通过红外光谱(IR)、比旋光度测定进行结构表征,并借助电位滴定仪进行含量分析。
1.1 原料、试剂及仪器
L-Arg,Food grade,宁波市镇海海德生化科技有限公司;纯化水,通过二级反渗透系统制得;MnSO4,AR,上海化学试剂二厂;KBr,AR, 汕头市西陇化工厂;C2H5OH,AR,溧阳光源工贸;CH3COCH3,AR,溧阳光源工贸;市售黄豆、牛肝;
郑州杜甫仪器厂SHB-3循环水式多用真空泵、上海索光WZZ-2D自动旋光仪、天津拓普仪器 TJ270-30(A)双光速红外分光光度计、常州国华电器HH-2数显恒温水浴锅、上海一恒HG-9123A电热鼓风干燥箱、梅特勒T50电位滴定仪。
1.2 步骤
将L-Arg作为底物溶于纯化水中配成转化液,并控制pH(8.5~10.0)在此范围,加入Arginase、Mn2+,并放置恒温TA(33~42℃)条件下反应TA(10~40h)后;加入Urease,并控制温度TB(36~40℃)在此恒温反应TB(40~70min),再经酸化、脱色过滤、浓缩至有少量晶体析出,加入乙醇进行回流、冷却结晶,过滤收集析出的结晶,或进一步重结晶提高产品纯度,再经干燥后得成品。
2 结果与讨论
2.1 单因素实验
2.1.1 反应pH对产率的影响(表1)
图1 L-鸟氨酸盐酸盐的红外光谱图
表1 反应pH对产率的影响
表2 反应温度TA 对产率的影响
由表1可知,9.3为该反应体系中酶的最适pH,pH过高或过低对酶的活性均受到一定的抑制作用,从而影响酶的活性发挥。
2.1.2 反应温度TA对产率的影响(表2)
由表2可知,反应温度TA过低,造成反应无法快速进行彻底,反应温度较高的条件下,反应比较完全,但温度过高会导致副产物的增多,从而影响产率,温度为38.5℃时,可获得较高收率。
2.1.3 反应时间TA对产率的影响(表3)
由表3可知,反应时间TA是决定反应是否完全的关键因素,时间不足,反应不能完全进行,反应时间过长会造成能源浪费,并且影响生产效率,反应时间15h为最佳。
2.2 红外光谱分析(图1)
表3 反应时间tA 对产率的影响
图1中a谱线为医药级标准品L-Orn HCl的红外光谱,b谱线为使用纯化水重结晶得到的L-Orn HCl红外光谱,c谱线为未经重结晶得到的L-Orn HCl红外光谱。可见在1680-1550cm-1 间较宽的中等强度吸收峰及在1250-1000cm-1间的弱峰均与标准品一致。
3 结论
采用双酶偶合法制备L-Orn HCl,得到最佳的酶催化合成工艺条件为:将L-Arg作为底物溶于纯化水中配成10%的转化液,控制pH9.3条件下,加入Arginase、Mn2+,并在38.5℃恒温条件下反应15h后;加入Urease,恒温反应60min,再经酸化、脱色过滤、浓缩至有少量晶体析出,加入乙醇进行回流、冷却结晶,过滤收集析出的结晶,或进一步重结晶提高产品纯度,再经干燥后得成品。在此条件下,L-Orn HCl的产率为83.5 %,熔点为245.2℃~245.6℃ ,旋光度为23.9°~24.3°( C=4,6N HCl),含量为99.7%。
[1]L-鸟氨酸盐酸盐结晶新工艺研究[J].食品工业科技,2010(12).
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