低温定向冷冻法冻存食蟹猴精液的研究

唐丹等

摘要

[目的]使用低温定向冷冻方法建立有效的精子冻存条件。[方法] 采用低温定向冷冻方法冻存食蟹猴精液，并与常规方法进行对比，探讨冷冻方法和甘油浓度对精子冷冻存活率的影响。[结果] 在相同甘油浓度下，低温定向冷冻的食蟹猴精子

的活力与顶体完整性显著高于常规冷冻法（P<0.05），定向冷冻方法在保存食蟹猴精液效果明显优于常规冷冻方法， 且甘油浓度5%时能够达到更好的冷冻效果。[结论]与常规冷冻相比，低温定向冷冻能显著提高精子存活率。在食蟹猴的精液冻存中，采用定向冷冻仪冻存精液能达到较好的冻存效果。

关键词食蟹猴； 精液冷冻； 甘油； 常规冷冻；低温定向冷冻

中图分类号S865.3+1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01699-03

Abstract [Objective] The research aimed to establish the effective preservation method of frozen sperm by directional freezing technique. [Method] The sperm of M. fascicularis was frozen by directional freezing technique and it was compared with conventional freezing technique. The effects of freezing method and glycerol concentration on the freezing survival rate of sperm were discussed. [Result] At the same concentration of glycerol， The sperms motility and acrosome integrity of M. fascicularis by directional freezing technique were higher than that by conventional freezing technique. The preservation effects of sperm of M. fascicularis by directional freezing technique were obviously better than that by conventional freezing technique. And the best freezing effects were obtained with 5% glycerol. [Conclusion]Compared with conventional freezing technique， directional freezing technique could enhance the survival rate of sperm. Better freezing effects were obtained when the sperm of M. fascicularis was frozen by using directional freezing instrument.

Key words Macaca fascicularis； Sperm cryopreservation； Glycerol； Conventional freezing； Directional freezing

由于生物學特性与人类极其相似等原因食蟹猴已成为生物医学中使用广泛的一种实验动物，同时它也属于《濒危野生动植物物种国际贸易公约》（2003 年修订版）的二级保护动物，属于濒危物种[1]。因此，对食蟹猴的生殖繁殖显得尤为重要，食蟹猴人工授精作为人工辅助生殖技术已经普遍运用于食蟹猴生殖过程中，人工受精的前提条件是建立优良的精子库，因此高效的精子冷冻方法对于食蟹猴的生殖繁殖、优良资源遗传基因的保存具有重要意义。

目前，对于食蟹猴精液保存的研究已有大量报道[2-9]，而体外受精成功率却一直不高，这可能是由于冷冻过程中精子受损严重，冻存复苏后精子存活率明显下降。灵长类动物精子冷冻使用最广泛的是常规冷冻方法，即冻存麦管悬放于液氮上空，通过液氮蒸气实现降温冷冻，此方法简单快捷，较易实现，因此也在精液保存中被普遍使用，但正是因为其装置简单，许多因素不能控制，受人为因素的影响太多。

近年来，一种新的冷冻方法——低温定向冷冻法被运用于精液冷冻上，已经成功用于许多动物精液的冷冻保存[10-17]，人们将欧洲野兔定向冷冻后的精子与新鲜精子同时用于人工授精，结果发现2组兔子在受孕率等方面并无显著差异[13]。定向冷冻后的精子用于人工受精成功孕育了世界上第一只小犀牛[12]。定向冷冻的特点是基于多重温度梯度的原理，装有精液的冷冻管以精确可控的速率进入设定不同温度的2个低温冷冻仓中，使精子降温速率精确可控，在这个定向降温过程中有效减少了胞内冰晶的形成，减少对精子的损伤。与定向冷冻相比，常规冷冻由于降温速率不能人工控制，对冰晶形成也不可控，对精子的伤害更大。笔者用低温定向冷冻方法冻存食蟹猴精液，并与常规方法进行对比，探讨其对食蟹猴精子的冻存效果，以冷冻复苏精子的活力、冻后复苏率和顶体完整率作为精子冻存复苏后功能状态的检测指标。

1 材料与方法

1.1实验动物

试验所用精液来自3只成年健康雄性食蟹猴（7岁），均由昆明亚灵生物科技有限公司提供且达到实验动物管理要求标准，每只食蟹猴单笼饲养，保持每日12 h光照与黑暗，22 ℃恒温。试验项目提前获得了昆明亚灵生物科技有限公司动物使用和管理委员会的批准。

1.2精液采集

肌肉注射盐酸氯胺酮（5 mg/kg体重）麻醉食蟹猴，通过阴茎电刺激法采集精液[18]。收集精液于37 ℃水浴中液化30 min 后，取10 μl用于检测精子活力和顶体完整性，剩余部分用预热的TALP-Hepes+0.3%BSA进行适当稀释[19]，200 g离心10 min洗去精浆，重复2次后去掉上清液，轻柔混匀沉淀部分用于精子冷冻。

1.3防冻液的配制

精子冷冻稀释液（Sperm-diluting medium）的成分参照TTE[8]。将称取的物质溶解于Milli-Q水中并定容，将溶液置于室温下以7 000×g的速率离心1 h，以去除卵黄颗粒，然后收集上清液，用NaOH 或HCl调节pH至7.2，将上清液分装并储存于-80 ℃冰箱中待用。试验前于37 ℃水浴中解冻，按比例加入不同浓度的甘油，制成食蟹猴精子防冻液（TTE-G）。

1.4精子冷冻保存与解冻复苏

洗过的精液用预热至37 ℃的不含甘油的TTE稀释10倍，平均分成2份放入10 ml试管中并封口。将试管浸入500 ml装有室温水的烧杯中，并置于4 ℃的冰箱中缓慢降温2 h。向2个试管中分别加入等体积的、预冷至4 ℃、含有4%与10%甘油的精子冷冻液TTE-G，因此甘油的终浓度为2%与5%（本过程中TTE-G的加入共分5次加完，每次加入1/5 体积，间隔6 min）。2%和5%的甘油浓度的精液分别又分成2份，一份进行常规冷冻，一份进行定向冷冻。

1.4.1

常规冷冻。将稀释好的精液分装入预冷至4 ℃的冷冻麦管（0.25 ml）中，封口机封口。向1个大小为35.7 cm×35.7 cm×39.7 cm的塑料泡沫盒内注入液氮，平衡20 min，并保持液氮深度为10 cm。将麦管水平放置在1个10 cm×10 cm大小的铝架上，将铝架悬挂于塑料泡沫盒内，于液氮面上方5 cm处冷冻10 min后投入液氮保存。解冻时将冷冻麦管于37 ℃ 水浴中2 min，检测精子活力和顶体完整性。

1.4.2

定向冷冻。稀释好的精液1 ml装入冷冻玻璃管（2 ml）中，放入定向冷冻仪中，玻璃管以1.5 mm/s的速度从A舱向左到达B舱，其中A舱为4 ℃，B舱为-50 ℃，最后玻璃管进入-70 ℃的收集舱中，最后放入液氮中保存[17]。

解冻时将冷冻管从液氮中迅速取出，停留在空气中90 s，直接投入37 ℃水浴中2 min，迅速搅动使精子解冻复苏，然后测定活力和顶体完整性[17]。

1.5精子功能的检测

1.5.1

精子运动度的检测。

精子运动度（即精子活力）是呈直线运动的精子占全部精子总数的百分率。将新鲜精液与解冻复苏后的精液稀释至适当浓度后，取10 μl置于预热至37 ℃的载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下计数直线前进运动精子与非直线运动精子的比例，计算出活力，每次至少计数200个精子，每份样品计数3次。最后精子活力为3次计数所得活力的平均值。

精子运动度复苏率是精子冷冻复苏运动度与新鲜精子运动度的比值，用以体现精子冻后运动度恢复力的重要参数之一。

1.5.2

顶体的完整性。按照以下公式计算顶体完整性：

顶体完整率（﹪）=顶体完整精子数/精子总数×100﹪。

新鲜或冷冻精液（调节精子悬液的浓度为40×106～60×106个/ml）涂片空气干燥，然后用无水乙醇固定30 min，涂片再次空气干燥。将100 μl 40 μg/ml FITC标记的花生凝集素（FITC-PNA）覆盖涂片，37 ℃避光孵育30 min后PBS冲洗。使用荧光显微镜观察顶体的荧光着色状态，顶体完整的精子被染成均匀的苹果绿色，而顶体不完整的精子部分着色或不着色。分别记录顶体完整精子占精子总数的百分率。每份样品制作2 个涂片，每个涂片观察200个以上的精子（分左、右2个区），取2片的平均值。

1.6试验设计

共用精液10份，来自3只食蟹猴，每份精液平均分成2份，一份用于常规冷冻，另一份用于定向冷冻，用于常规冷冻的精液一部分用含2%甘油浓度的防冻液冻存，另一部分用含5%甘油浓度的防冻液冻存，且保证2份精液的冷冻同时进行，定向冷冻也同常规冷冻一样采用2种甘油浓度的冷冻液冻存（2%，5%），也同时进行冷冻。冷冻后的精液解冻后检测活力与顶体完整性，作为检测精子功能状态的指标。3 讨论

甘油是灵长类动物精子冷冻保存中使用最广泛的冷冻剂[20]，属于渗透性保护剂，在冷冻过程中渗入精子内部，浓缩细胞内水分，减少胞内冰晶的形成，达到保护精子的作用，甘油在渗入细胞的同时也会改变质膜的性质，导致膜的稳定性和通透性发生改变，如果这种改变幅度过大，大于冰晶形成的伤害，便会损伤精子，因此甘油浓度应控制在一定范围内，若甘油浓度过高或过低都会对精子造成损伤。近年来已有许多关于食蟹猴甘油浓度的研究，普遍认为常規方法冷冻食蟹猴精液甘油的最适浓度范围为3%～5%，若小于3%或大于5%，冷冻效果都会下降[5-6，8-9]。在该试验中常规冷冻下当甘油浓度降到2%，冻后活力与顶体完整性都下降，当低于最适甘油浓度5%时，降低甘油浓度会导致精子存活率的降低，而作为一种更有效地冷冻方法——低温定向冷冻方法，它相对于常规冷冻能更有效地减少冰晶的形成，对精子的伤害更小。结果表明，当甘油浓度为2%时，冻后活力与顶体完整性显著高于常规冷冻2%（P<0.05），还高于常规冷冻5%（P>0.05），定向冷冻在较低甘油浓度下，取得比常规冷冻更好的冷冻效果。这表明定向冷冻能降低甘油浓度，当将常规冷冻的最适甘油浓度用于定向冷冻中时，冻后精子存活率不仅高于常规冷冻5%时（P<0.05），也显著高于常规冷冻2%组（P>0.05）。这表明常规冷冻的最适甘油浓度5%同样适于定向冷冻，定向冷冻不仅在降低甘油浓度时达到更好的冷冻效果，当甘油浓度增加到5%时达到最好的冷冻效果。从精子冻后复苏率来看，定向冷冻5%时精子复苏率最高，高于甘油浓度为2%时（P>0.05）。综上所述，无论甘油浓度高（5%）还是低（2%），定向冷冻都优于常规冷冻，当甘油浓度为5%时，冻存效果达到最佳。

定向冷凍优于常规冷冻，这不仅是因为定向冷冻严格控制降温速率，使精子缓慢适应低温环境，减少冰晶形成，定向冷冻还有许多优于常规冷冻的方面，由于定向冷冻一开始就是为了精子的冷冻而设计发明的，其最小冷冻量为2 ml，与常规冷冻相比它能实现精液的大剂量冻存，这相对于常规冷冻的麦管（250 μl/管）既能节省时间，又能避免精液装管的时候温度波动对于精子的影响，许多操作技术（如精子的性别鉴定等）都需要大量精子作为研究对象，定向冷冻满足了这一点。常规冷冻过程中由于麦管数量较多，在保存过程中容易造成不同冻存麦管的混淆与丢失，并且也增加了冻存的空间。而定向冷冻避免了这些问题。大剂量冻存的精液相对于麦管冻存能够抵御操作者在选取目标样本过程中造成的温度变化，其在室温下能保持在-100 ℃ 2 min，这使操作者有足够时间挑选所需要的样本精液，这是常规冷冻所无法做到的。

目前，运用定向冷冻方法对非人灵长类精子进行保存的并不多，仅见猕猴[21]，在猕猴研究中定向冷冻与常规冷冻对精子的活力和顶体完整性差异不大，这可能是由于不同物种以及不同个体精子的耐受度不同。笔者首次尝试用定向冷冻方法冻存食蟹猴的精液，运用此方法不仅能有效促进食蟹猴优良遗传资源的保存，也能充分发挥优良食蟹猴的繁殖效率。

综上所述，与常规冷冻相比，低温定向冷冻能够显著提高精子存活率，因此在食蟹猴的精液冻存中，有条件的情况下尽量采用定向冷冻仪冻存精液，能够达到良好的冻存效果。

42卷6期唐 丹等低温定向冷冻法冻存食蟹猴精液的研究

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