激素配比与茎尖大小对甘薯脱毒苗培育的影响

卢玲　 聂明建　 代力

摘要 [目的]研究激素配比与茎尖大小对甘薯脱毒苗培育的影响。[方法]以高淀粉甘薯品种湘福1号和美国SL9为材料，进行甘薯脱毒苗培育试验。[结果]湘福1号在MS+0.8 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+0.05 mg/L GA3培养基中，愈伤组织生长最快，成苗率最高，1次培养成苗率比转移的2次培养成苗率高24.5%，秧苗素质也好；美国SL9茎尖所带叶原基越多，则成苗率越高，脱毒率越低。[结论]综合成苗率与脱毒效果认为，以带2个叶原基的茎尖在含有激素的培养基中的培育效果最好。

关键词 甘薯（Dioscorea esculenta）；茎尖；激素；成苗率；脱毒率

中图分类号 S632 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）08-02276-02

Effects of Hormone Ratio and Shoot Tip Size on Dioscorea esculenta VirusFree Seedlings Culture

LU Ling， NIE Mingjian et al （Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128）

Abstract [Objective] To study effects of hormone ratio and shoot tip size on Dioscorea esculenta virusfree seedlings culture. [Method] With Xingfu No.1 and America SL9 as test materials， Dioscorea esculenta virusfree seedlings culture was conducted. [Result] The callus growth of Xiangfu No.1 in medium MS+0.8 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+0.05 mg/L GA3 is the fastest and seedling rate is the highest， onetime culture seedling rate is higher than twotime culture seedling rate of 24.5%； The seedling rate of America SL9 is higher and virusfree rate is lower with more of leaf primordium in shoot tip. [Conclusion] Considering seedling rate and virusfree effect， the shoot tip with 2 leaf primordium in culture medium containing hormone has the best culture effect.

Key words Dioscorea esculenta； Shoot tip； Hormone； Virusfree rate

甘薯（Dioscorea esculenta）體内感染了病毒病后会产生植株变小、分枝减少、叶片皱缩、生长势衰退、块茎变小、产量品质明显下降，甚至丧失生产利用价值的现象。利用茎尖分生组织培育脱毒甘薯苗进行栽培应用，是防止甘薯病毒危害、提高甘薯产量和质量最有效的方法。

甘薯脱病毒苗培育技术自20世纪80年代引入我国，国内学者对其进行了大量研究，主要针对在甘薯茎尖表面消毒方法、消毒剂种类、消毒剂浓度及处理时间、培养茎尖的大小、培养基的成分、激素的浓度以及甘薯愈伤组织培养的温光条件等方面，开展了一系列的研究工作，取得了很多成果[1-5]。何新民等以红姑娘2号甘薯为材料诱导产生愈伤组织和丛芽阶段，以MS+1.0 mg/L 6BA+0.01 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3培养基培养的效果较好；而1/2MS+0.2 mg/L NAA是红姑娘2号试管苗的适宜生根培养基[6]。湖南是甘薯生产大省，甘薯年种植面积在15～20万公顷，以高淀粉含量甘薯生产为主，据不完全统计，全省每年因甘薯病毒病造成的产量损失在30%以上。因此，笔者对湖南高淀粉甘薯品种脱毒苗培育技术进行研究，以期为高淀粉甘薯品种脱毒苗的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。供试品种为湘辐1号和美国SL9，淀粉含量分别达27%和25%，是湖南省目前栽培面积较大、产量及经济性状均表现较好的2个高淀粉甘薯品种。

1.1.2 主要仪器。分析天平，购自德国赛多利斯公司；超净工作台，购自苏州苏洁净化设备公司；纯水机，购自深圳市佐泰超声自动化设备有限公司；高压灭菌锅，购自中远机械有限公司；光照培养箱，购自常州恒德仪器有限公司；酸度计，购自梅特勒-托利多国际股份有限公司；水浴锅，购自江苏省金坛市环宇科学仪器厂。

1.1.3 主要药剂。乙醇、次氯酸钠、琼脂、蔗糖、MS培养基、6BA、NAA、GA3、氢氧化钠和盐酸等均为国产分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1 种薯的催芽。选择上一年收获的中等大小、无病无伤、皮色鲜亮的甘薯，放入40～50 ℃恒温水浴锅中浸泡10 min，浸泡时需翻动种薯，保证种薯受热均匀，然后按品种分类将种薯放置在32.5 ℃、相对湿度为80%的光照培养箱内进行催芽培养，当种薯出现了芽尖时将温度调至25～28 ℃，继续培养。

1.2.2 接种前准备。用浓度70%酒精擦拭培养器皿、解剖刀、剪刀和镊子等接种器具。超净工作台先用浸有浓度70%酒精的脱脂棉擦洗，再经紫外灯照射50 min消毒。组培瓶、培养皿、枪镊等工具均需经高压蒸汽灭菌锅灭菌。

1.2.3 外植体处理。甘薯出苗后，剪取生长健壮薯苗茎尖顶端2～3 cm，然后用饱和洗衣粉液浸泡消毒30 min，无菌水冲洗4～5次后，采用2步法表面消毒：先将甘薯茎尖先用浓度70%酒精浸泡30 s，再浸入浓度2.5%的NaClO水溶液消毒5～10 min，最后用无菌水冲洗4～5次，用无菌纸吸干，在解剖镜下切取0.4～0.5 mm带1～2个叶原基的甘薯微茎尖。

1.2.4 接种。打开组培瓶塑料盖，用火焰烧瓶口并转动瓶口，将枪镊在火焰上消毒后蘸入无菌水冷却，轻夹起已剪好的微茎尖接种至组培瓶内的培养基上，盖上塑料瓶盖。

1.2.5 茎尖培养。将接种好的培养瓶放在人工气候室中，培养室的条件设置为：温度 25～28 ℃，相对湿度80%，光照时间14 h/d；光照强度2 000～3 000 lx。

1.2.6 病毒检测。脱毒苗的检测首先采取目测法淘汰弱苗和显症苗，再按王庆美改进的 NCMELISA法进行甘薯组培苗的病毒检测[7]。

1.2.7 培养基的配制。甘薯茎尖分生组织的培养常用MS培养基，先配制MS母液，放入冰箱中保存待用，配制培养基时每升MS培养基母液中加入30 g蔗糖，然后用酸度计调整pH为5.8，按照试验所设计的处理浓度将激素溶解在上述MS母液中，再加7 g琼脂粉，分装于组培瓶中，在121～126 ℃高压灭菌锅中灭菌20 min，取出冷却备用。

1.2.8 培养方式的选择。①不同激素对甘薯茎尖分生组织培养的影响。以MS为基本培养基，然后根据生长激素配比的不同设计成8个处理。全部8个处理都添加了细胞分裂素6苄氨基嘌呤（6BA）和植物生长调节剂萘乙酸（NAA），其中编号1、2、5、6处理6BA浓度为0.4 mg/L，其他处理6BA浓度为0.8 mg/L，浓度增加1倍；编号1、3、5、7奇数处理NAA浓度为0.1 mg/L，偶数号2、4、6、8处理NAA浓度为0.2 mg/L，浓度增加1倍；另外，编号5、6、7、8处理添加了0.05 mg/L的赤霉素（GA3）（表1）。按“1.2.3”所述步骤处理湘辐1号外植体，然后剥离微茎尖（含2个叶原基），接种到各处理编号的培养基上，每个编号的培养基重复2次，每个重复5个微茎尖。在相同的培养条件下培养30 d，统计茎尖培育的愈伤组织直径、成苗率。②茎尖大小对分生组织培养的影响。从美国SL9种薯上剪取芽尖，按“1.2.3”所述步骤消毒后，在解剖镜下切取茎尖，进行接种培养。茎尖大小分为3个不同水平，分别带有1、2和3个叶原基，培养基为MS培养基加0.8 mg/L 6BA和0.2 mg/L NAA，人工气候室的条件与“1.2.5”相同，培养30 d统计成苗率，待茎尖长成完全植株，叶片展开时按“1.2.6”方法检测其脱毒率。③不同培养方式对茎尖分生组织培养的影响。剥离的茎尖分生组织采用2种培养方式：1种是始终在筛选的激素培养基上培养，称为1次培养，培养基组成为MS培养基加0.8 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+0.05 mg/L GA3；另1种是2次培养，即在激素培养基上培养20 d左右，待茎尖分生组织膨大变绿后，转到1/2 MS无激素的固体培养基上培养。以湘辐1号为试验材料，统计50 d后成苗率、茎尖芽数，叶片数、平均株高。

1.2.9 数据处理。采用DPS数据处理和Excel进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 不同培养基的茎尖分生组织培养效果分析 由表2可知，随着6BA浓度升高，愈伤组织形成越快，面积越大、成苗率越高。处理1、2、5、6的6BA浓度愈为0.4 mg/L，愈伤组织平均直径为26 mm，成苗率为48.5%；而处理3、4、7、8的6BA浓度愈为0.8 mg/L，愈伤组织平均直径为30 mm，成苗率为50.2%，6BA浓度为0.8 mg/L的处理与0.4 mg/L处理相比，愈伤组织直径增大15.4%，成活率高1.7%。

培养基中NAA浓度对甘薯茎尖愈伤组织形成的影响与6BA 相似，浓度升高，愈伤组织形成越快，面积越大、成苗率越高。处理编号2、4、6、8的愈傷组织平均直径为30 mm，成苗率为50.8%；平均直径比处理编号的1、3、5、7大4 mm，成苗率高2.9%。

GA3对甘薯组织培养也有重要影响，添加了0.05 mg/L GA3后，愈伤组织平均直径为32.3 mm，而未添加GA3的愈伤组织平均直径仅为23.8 mm，前者比后者直径增大35.7%，这说明GA3有促进甘薯愈伤组织生长的作用。在没有添加0.05 mg/L GA3 的情况下，6BA浓度对甘薯茎尖愈伤组织形成的快慢及直径大小影响更大，处理3、4的愈伤组织平均直径为27 mm，处理1、2的为20.5 mm。6BA浓度为0.8 mg/L的处理比0.4 mg/L处理相大31.7%，说明添加GA3可以部分抵消6BA浓度差异对愈伤组织培育的影响。

2.2 茎尖大小对分生组织培养的影响 由表3可知，茎尖大小对分生组织培养有很大的影响。茎尖带1、2和3个叶原基的成苗率分别为30.5%、50.1%和79.4%，带3个叶原基的茎尖分别比带2个和1个叶原基的茎尖成苗率高29.3%和48.9%，表明茎尖大小与组织培养的成活率呈正比。脱毒率则正好相反，茎尖越大，脱毒效果越差，带1、2和3个叶原基茎尖的脱毒率率分别为50.2%、42.7%和27.9%，带1个叶原基的茎尖比带2个和3个叶原基的茎尖脱毒率分别高7.5%和22.3%，表明茎尖大小与脱毒率呈反比。在培养过程中还发现，带1个叶原基的茎尖比带2个叶原基、3个叶原基愈伤组织生长慢，根和叶分化也慢。

2.3 不同培养方式对茎尖分生组织培养的影响 由表4可知，1次培养的成苗率、茎尖芽数、叶片数和平均株高都比2次培养的高。1次培养比2次培养成苗率增加了24.5%，茎