天竺桂叶片抗寒性生理生化指标测定及综合评价

李红喜，陈新会，康战芳，陈秋红



天竺桂叶片抗寒性生理生化指标测定及综合评价

李红喜，陈新会，康战芳，陈秋红

（栾川县林业局，河南 栾川 471500）

通过低温胁迫实验，对河南栾川和湖北襄阳天竺桂叶片的含水量、相对含水量、脯氨酸含量、叶绿素含量、细胞膜透性、MDA含量、可溶性蛋白质含量、SOD活性、CAT活性、APX活性等生理生化指标测定。综合各项指标表明河南栾川天竺桂叶片耐受低温为-20℃，湖北襄阳天竺桂叶片耐受低温为-16℃。

天竺桂；抗寒性；生理生化测定；评价

天竺桂属于亚热带植物，志书记载均分布在伏牛山南坡以南的亚热带地区，伏牛山北坡暖温带地区没有分布[1]。2004年，通过对暖温带地区伏牛山北坡调查，天竺桂野生资源在栾川县老君山自然保护区首次发现，2005年在栾川县龙峪湾国家森林公园发现小型群落，2010年在栾川县潭头镇发现原生群落，最大直径28 cm。野生天竺桂在栾川的发现，突破了常规栽培的北限，扩大了天竺桂的栽培范围，改变了天竺桂只能南方栽培的格局，这为天竺桂在北方栽培和绿化，提供了前所未有的契机，具有重大的科研价值和市场空间[2]。

目前国内对天竺桂引种适应性实验和生理生化机制研究较少，为了对天竺桂的引种提供有价值的参考，并通过天竺桂抗寒生理生化研究，为天竺桂引种驯化及繁育开发提供科学依据。2013年1月，在河南科技大学农学院实验室对河南栾川天竺桂和湖北襄阳天竺桂进行抗寒生理生化指标进行测定。

1 材料与方法

1.1 植物材料

为湖北襄阳天竺桂和河南栾川天竺桂叶片。采集地点：河南省栾川县苗圃。

1.2 试验试剂及仪器

1.2.1试验试剂

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、核黄素、甲硫氨酸、EDTA-Na2、氯化硝基四挫蓝、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、L-抗坏血酸钠、过氧化氢、可溶性聚乙烯吡咯烷酮、考马斯亮蓝-G250、冰醋酸、磷酸、无水乙醇、3%磺基水杨酸、冰乙酸、酸性茚三酮、甲苯。

1.2.2试验仪器

BL-610分析天平和BS-200S型分析天平、pHS-3型数显酸度计、3K18台式高速冷冻离心机、HH-S2数显恒温水浴锅、TU-1810紫外可见分光光度计、2XZ-1型真空泵、DZG-6090型真空干燥箱、78-1型磁力加热搅拌器、Sigma移液枪、TYS-3N叶绿素检测仪、DDS-307型电导率仪、BCD-28EMC型冷藏冷冻箱。

1.3 试验方法

对所采集的天竺桂枝叶用保鲜箱送至实验室，放置于低温程序控制冰箱中，模拟自然条件下的低温状况，温度分别设置为4℃、-4℃、-8℃、-12℃、-16℃、-20℃，室温CK作为对照。低温程序控制冰箱每10 min下降1℃，到所需的温度后放置24 h，然后取出部分样品放置于室温下15 h后进行测定。剩下的样品继续按设定梯度处理。

1.3.1叶片含水量的测定

取低温胁迫的天竺桂叶片，每个温度为一组，随机取2~3片叶，称重并记录；然后将叶片放入盛有自来水的培养皿中，室温放置8 h，取出称重记录；将叶片用报纸包裹并标记，在电热恒温干燥箱中80℃烘12 h后称干重并记录。

1.3.2游离脯氨酸含量测定

取不同处理的剪碎混匀天竺桂叶片0.4 g，分别置于大试管中，加入5 ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10 min。取出试管冷却后，吸取上清液2 ml，加2 ml冰乙酸和3 ml显色液，于沸水水浴中加热40 min，下一步操作按标准曲线制作方法进行甲苯萃取和比色，记录吸光值。

1.3.3叶绿素含量测定

随机选取5~6片低温胁迫的叶片，用手持叶绿素检测仪对叶片不同部位进行叶绿素含量测定并记录。

SOD、APX、CAT酶活性及MDA、可溶性蛋白质含量和相对电导率大小测定参考赵世杰等、叶宝兴方法[3-4]。

1.4 数据处理

MierosoftExel作图；SPSS13.0做统计分析。

2 实验数据

低温胁迫下，湖北襄阳天竺桂和河南栾川天竺桂叶片的含水量和相对含水量、脯氨酸含量、叶绿素含量、细胞膜透性、丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白质含量、SOD活性、过氧化氢酶（CAT）活性、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性等生理生化变化情况如图1~8。

图1 天竺桂叶片细胞膜透性变化

图2 天竺桂叶片脯氨酸含量变化

图3 天竺桂叶片叶绿素含量变化

图4 天竺桂叶片可溶性蛋白含量变化

图5 天竺桂叶片丙二醛（MDA）含量变化

图6 天竺桂叶片过氧化氢酶（CAT)含量变化

图7 天竺桂叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性变化

图8 天竺桂叶片过氧化物酶（APX）含量变化

3 小结

植物对低温胁迫的响应是积极主动的应激过程，低温诱导相关基因的表达[5]。抗寒性指植物不受冻害所能忍耐的冰冻温度[6]。环境胁迫下植物的抗性反应是一个复杂的生理、生化、生态过程，并且各种生理生化反应之间相互影响、相互作用。由于植物的抗寒性是受多种因素的影响而形成的，它涉及到植物的组织结构功能和一系列生理生化问题。通过低温胁迫实验，测定了包括叶片含水量和相对含水量、脯氨酸含量、叶绿素含量、细胞膜透性、MDA含量、可溶性蛋白质含量、SOD活性、CAT活性、APX活性等生理生化指标，进一步分析了不同地区天竺桂抗寒性与每一种指标之间的关系。通过这项指标可以看出，河南栾川天竺桂抗寒性高于湖北襄阳天竺桂。

在遇到低温伤害时，湖北襄阳天竺桂叶片比河南栾川天竺桂叶片细胞膜透性变化要大。在透性达到最大值的低温温度上，湖北襄阳天竺桂抗性是-16℃，河南栾川天竺桂是-20℃。按照细胞膜透性越大，则其抗性越小的理论，湖北襄阳天竺桂抗寒性不如河南栾川天竺桂。

在低温胁迫过程中，当低温降至-20℃时，MDA含量变化出现两种情况，河南栾川天竺桂MDA含量上升，湖北襄阳天竺桂MDA含量下降，表明在-20℃时河南栾川天竺桂叶片受害持续，还有生命特征，湖北襄阳天竺桂叶片基本死亡，基本没有生命特征。同时，在低温胁迫过程中，河南栾川天竺桂和湖北襄阳天竺桂相比，其MDA含量较低，变化幅度较小，说明河南栾川天竺桂抗寒性大于湖北襄阳天竺桂，这与苹果砧木低温胁迫研究得出的结果一致[7]。

在低温胁迫过程中，不同地区天竺桂酶促清除系统反应不同，酶促清除系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化氢酶(CAT)等[107]。河南栾川天竺桂叶片在温度降至4℃时，SOD、CAT、APX活性全部启动，协同抵御不良环境；随着温度下降，SOD和CAT活性最先降低（-4℃），最后是APX（-8℃）；接着CAT活性被再次激活（-8℃），其次SOD活性也被激活（-12℃），最后是APX（-16℃）；到-16℃时SOD、APX活性被继续激活，CAT活性下降；到-20℃时只有SOD活性被继续激活，CAT、APX活性下降，表明河南栾川天竺桂自身生理机能较差，自身抗性降到较低水平。湖北襄阳天竺桂叶片在温度降至4℃时，APX和CAT活性最先降低（-4℃），SOD活性慢慢唤醒；随着温度下降，APX活性被唤醒（-4℃），到-8℃CAT活性才被激活，表明在遇到低温危害时，湖北襄阳天竺桂自身反应机制较慢；在低温降到-16℃时，APX活性急速下降，CAT活性急速上升，SOD活性在也-12℃以下变化不大；到-20℃时只有CAT活性被继续激活，SOD、APX活性下降，表明湖北襄阳天竺桂自身生理机能较差，自身抗性降到较低水平。从低温胁迫过程不同地区天竺桂酶促清除系统活性对比可以看出，SOD活性相近，CAT、APX活性相比河南栾川天竺桂均低于湖北襄阳天竺桂，酶促清除系统是由于膜脂过氧化作用变化而变化的，这表明在抵御细胞膜的脂质过氧化过程中，河南栾川天竺桂均自身调节、回避机制高于湖北襄阳天竺桂，也就是说河南栾川天竺桂自身的适应能力大于湖北襄阳天竺桂，使得在低温胁迫下，河南栾川天竺桂对不良环境的反应小于湖北襄阳天竺桂。

河南栾川天竺桂叶片含水量均低于湖北襄阳天竺桂，表明河南栾川天竺桂在自然适应过程中，通过降低叶片含水量来抵御低温危害；在叶片相对含水量对比试验中，河南栾川天竺桂自由水/束缚水变化比湖北襄阳天竺桂反应较慢，变化幅度较小。游离脯氨酸含量、可溶性蛋白、叶绿素含量变化也能说明这一现象，通过两个地区天竺桂叶片对低温反应过程中游离普氨酸、可溶性蛋白、叶绿素含量变化相比，湖北襄阳天竺桂变化较大、含量较高、反应敏感，河南栾川天竺桂变化较小、含量较底、反应不太敏感，也表明了河南栾川天竺桂抗寒性高于湖北襄阳天竺桂，同时这一实验结果与树种原生地极端最低气温和引种试验田间观察结果一致。

综合各项指标表明河南栾川天竺桂叶片耐受低温为-20℃，湖北省襄阳天竺桂叶片耐受低温为-16℃。

4 问题与讨论

由于不同温度处理是在低温程序控制冰箱中进行，相对于田间来说，其降温速度、恒定时间于田间有很大差异，所以通过自然降温不同时段采集的实验材料更能反映数据的真实性。

本次抗寒性试验仅采集天竺桂叶片进行试验，天竺桂小枝、根部低温、水分、盐分胁迫尚未进行，有待进一步研究。

由于此次进行抗寒生理生化测定所使用的叶片为离体叶片，于树体叶片存在差异，也影响了数据的可信程度，今后将利用自然降温过程采摘树体叶片进行试验以获取最真实的数据。

[1]丁宝章，王遂义．河南植物志第2册[M]. 郑州：河南科学技术出版社，1981.

[2]魏振铎．栾川县野生天竺桂资源保护初探[J]．河南林业科技，2010（02）：26-27．

[3] 赵世杰，史国安，董新纯，等. 植物生理学试验指导[M].北京：中国农业科学技术出版社，2002.

[4] 叶宝兴，朱新产. 生物科学基础实验[M]. 北京：高等教育出版社，2007.

[5] THOMASHOW M F. Sowhats new in the field of plant cold acclin ationLots[ J]．Plant Physio，2001，125：89-93．

[6] GLERUM C. Frost hardiness of coniferous seed lings p rinciples and appli cations[M] / DURYEA M L. Evaluating seedl ing quality.princip les，procedures, and predictive abilities of major tests. Corvall is, OR：Forest Reasearch Laborary，Oregon State University, 1985: 107-123．

[7]赵玲玲，宋来庆，刘志，等．低温胁迫下4种苹果砧木叶片多胺的变化[J]．果树学报，2008，25（2）：151-156．

2014-10-31

S 685.15

A

1003-2630（2014）04-0026-04

（责任编辑：王团荣）