去窦弓神经对大鼠脑细胞线粒体离子泵的影响1）

胡 庆，杨丽军，张山起，李淑贞，杨艳梅，顾 宇，刘 娜

动脉压力感受性反射的主要功能是维持血压稳定。切断主动脉弓和颈动脉窦压力感受器的传入神经，称为去窦弓神经（sinoaortic denervation，SAD），SAD 后 大 鼠 血 压 波 动 明 显［1］。随喂养时间的延长毛色逐渐失去光泽，精神日渐萎靡，对光、电刺激的反应性降低。线粒体的主要功能是氧化供能，其损伤将造成细胞能量缺乏，本实验的目的是探讨SAD 后大鼠脑细胞中线粒体中Na＋－K＋－ATP酶和Ca2＋－ATP酶活性的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD 大鼠50只，雌雄不拘，体重200g～250g，购自河北医科大学动物中心，随机分为5组：对照组、假手术组、SAD30d组、SAD 60d组、SAD 90d组，每组10只。

1.2 SAD 大鼠的制备和检验 大鼠用盐酸氯胺酮50 mg／kg加地西泮5mg／kg腹腔注射麻醉，同时腹腔注射硫酸阿托品0.5mg／kg以抑制呼吸道腺体分泌。麻醉后大鼠仰卧位固定，颈部正中切开，分离双侧主动脉神经及喉上神经并切断，暴露颈动脉窦区并去除该区的神经支配，用10%苯酚乙醇溶液涂擦，最后缝合切口。后肢肌内注射青霉素钠6×104U，完成整个SAD 手术［2］。假手术组不作神经分离和切除，其余步骤与SAD手术相同。术后3个组大鼠分别饲养30d、60d、90d。

SAD 大鼠按以上方法麻醉后行股静脉插管和经股动脉的低位腹主动脉插管，24h后在清醒自由活动状态下静脉注射去氧肾上腺素（深圳沃兰德药业）3μg／kg～5μg／kg，血压升高≥50mmHg，心率减慢＜20次／min，则认为SAD 完全。实验组全部合格。假手术组大鼠检验时，心率减慢为60 次／min～100次／min。

1.3 清醒、自由活动大鼠的血压监测 术后4周，在大鼠一侧腹股沟处切开，分离股动脉和静脉，用肝素化的聚乙烯导管分别进行动脉插管和静脉插管。插管另一端用引针经背部皮下至顶部穿出，用“马鞍”固定，术后大鼠置于隔音实验室内单独饲养。恢复24h后置于有机玻璃圆筒内，动脉导管经转动装置和灌注三通管与压力换能器连接，灌注三通管与恒速推注泵连接，1 mL／h推注20IU／mL肝素化等渗葡萄糖溶液。每搏血压信号经压力换能器转换为电信号，由分析系统（成都泰盟BL－420）实时记录并处理收缩压（SBP）、舒张压（DBP）。以每搏血压为基础，计算每个动物在24h内SBP、DBP的均数及标准差，标准差表示血压波动性（BPV）。分别计算24hSBPV 及DBPV［3］。

1.4 线粒体的制备 大鼠快速断头取出全脑，加入含有225 mmol／L 甘 露 醇、75mmol／L 蔗 糖、1 mmol／L EDTA、25 mmol／L Tris、0.25%牛血清白蛋白的分离介质10mL（pH 7.4），冰上匀浆，800g离心10min，取上清液，12 000g离心15min，取沉淀。以上过程重复2 次。取第2次沉淀物加入200μL分离介质，制成线粒体悬液，以Lowrry法测定蛋白质浓度［4］。

1.5 指标测定 Na＋－K＋－ATP酶、Ca2＋－ATP酶活性试剂盒购自南京建成生物工程研究所。用超声细胞粉碎仪将线粒体破碎，按试剂盒说明进行Na＋－K＋－ATP 酶、Ca2＋－ATP 酶的活性测定。

2 结 果

2.1 SAD 大鼠动脉血压及血压波动性变化 SAD30d 组、SAD60d组、SAD90d组、假手术组与对照组比较，24hSBP、DBP、SBPV、DBPV 以及收缩压和舒张压波动性差异无统计学意义；SAD 30d组、SAD 60d组、SAD 90d组24hSBPV、DBPV均显著高于对照组（P＜0.01）。详见表1。

表1 SAD大鼠24h动脉血压及血压波动性变化mmHg

表1 SAD大鼠24h动脉血压及血压波动性变化mmHg

与对照组比较，1）P＜0.01

组别 nSBP DBP SBPV DBPV对照组10 135.6±12.3 87.2±6.9 6.2±1.3 5.1±1.6假手术组 10 136.9±9.8 86.3±4.8 6.9±3.5 4.8±2.3 SAD30d组 10 138.1±1.6 84.8±6.7 14.2±3.81） 12.1±4.11）SAD60d组 10 133.9±9.1 85.6±9.8 13.8±4.31） 12.9±2.61）SAD90d组 10 137.6±5.6 87.5±3.8 13.2±2.31） 11.6±3.91）

2.2 SAD 大鼠脑细胞线粒体Na＋－K＋－ATP 酶、Ca2＋－ATP 酶的变化 假手术组与对照组比较Na＋－K＋－ATP 酶、Ca2＋－ATP酶均无变化；SAD30d组、SAD60d组与对照组比较，SAD90d组与SAD30d组、SAD60d组比较，Na＋－K＋－ATP 酶和Ca2＋－ATP酶活性明显降低（P＜0.01）。详见表2。

表2 SAD大鼠脑细胞线粒体Na＋－K＋－ATP酶、Ca2＋－ATP酶的变化 μmolpi／（mgprot·h）

表2 SAD大鼠脑细胞线粒体Na＋－K＋－ATP酶、Ca2＋－ATP酶的变化 μmolpi／（mgprot·h）

与对照组比较，1）P＜0.01；与SAD30d组、SAD60d组比较，2）P＜0.01

组别 n Na＋－K＋－ATP酶 Ca2＋－ATP酶对照组10 39.36±1.39 60.58±5.16假手术组 10 40.15±1.56 58.26±2.38 SAD30d组 10 31.26±2.091） 45.69±3.161）SAD60d组 10 30.98±1.681） 47.31±2.641）SAD90d组 10 21.38±2.012） 32.27±1.672）

3 讨 论

线粒体是真核细胞中重要的细胞器，具有氧化磷酸化、传递电子、贮存Ca2＋、能量代谢、抗氧化等重要生理作用，为细胞的生命活动提供能量，甚至可以决定细胞的存亡，起调控中心的作用［5］，其功能的实现依赖于膜结构的完整性。本实验结果说明手术创伤对大鼠脑细胞线粒体的结构和功能无损害。SAD 使线粒体膜流动性下降，引起Na＋－K＋－ATP 酶、Ca2＋－ATP 酶活性降低，线粒体发生Na＋、Ca2＋超载和水积聚，结构被破坏，进而使线粒体主要功能区内膜的完整性被破坏，从而导致氧化磷酸化解偶联，此时质子直接通过线粒体内膜回到基质，导致贮存在质子电－化学势能中的自由能消耗。这种变化可能参与了脑细胞能量代谢，进而导致神经系统功能障碍，而且随时间的延长日益严重。SAD 使线粒体膜流动性遭到破坏的机制有待进一步研究。

综上所述，SAD 引起的血压波动和神经元损伤可引起脑细胞内线粒体损伤，因此，维持血压稳定是维持大脑功能正常的重要方面，但SAD 对大脑功能的损害机制尚待进一步研究。

［1］ 王进，王敏伟，苏定冯.尼群地平和卡托普利协同降低去窦弓神经大鼠血压波动性的作用［J］.沈阳药科大学学报，2007，24（2）：98－101.

［2］ 史克勇，马秀娟，曹颖林，等.动脉压力感受性反射对盲肠结扎穿孔致脓毒症大鼠生存率的影响［J］.第二军医大学学报，2007，28（7）：705－707.

［3］ 李慧，孙宁玲.动脉压力感受性反射受损后血浆血管紧张素Ⅱ和内皮素1水平的明亮－黑暗周期变化［J］.中华高血压杂志，2006，14（8）：656－659.

［4］ Clark JB，Nicklas WJ.The metabolism of rat brain mitochondrin.Preparation and characterization［J］.J Biochem，1970，245（18）：4724－4731.

［5］ 李露斯，郑彩梅.大鼠脑线粒体呼吸功能测定的方法探讨［J］.第三军医大学学报，1994，16（6）：451－453.