牛磺酸合用维生素C上调钠钙交换mRNA 表达对大鼠酒精性脑损伤的保护作用1）

贾 涛，马云鹏，牛龙刚，杨彩红，张明升，张轩萍

长期大量饮酒可对机体多器官、多系统造成损害。目前已有多项研究揭示了饮酒与肝损伤之间的关系［1］，酒精对大脑的毒性作用也日益受到人们的重视。长期大量饮酒，酒精可干扰组织对氧化应激的防御系统，引起细胞膜中类脂和蛋白质的结构变化，改变神经细胞膜的流动性［2，3］和三磷酸腺苷的活性，阻碍钙的运输，引起神经细胞功能障碍，导致神经细胞死亡［4］。

牛磺酸（Taurine）具有广泛的生物学作用［5］，有促进神经系统发育和增殖分化的作用，与中枢神经系统正常生理功能的维持有密切关系［6］。维生素C是已知的抗氧化剂，能保持巯基酶的活性和谷胱甘肽的还原状态［7］，对组织氧化应激损伤具有保护作用。牛磺酸、维生素C及其两者合用对酒精性脑损伤有无保护作用？可能的机制何在？本实验通过建立大鼠长期饮酒模型，探讨牛磺酸、维生素C 及其二者合用对大鼠酒精性脑损伤组织形态学改变和钠钙交换mRNA 表达的影响，为酒精性脑损伤的预防和治疗提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 维生素C（Vitamin C），太原市振兴制药有限公司，批号：20100919。牛磺酸（Taurine），南京制药厂，批号：980923。50度北京二锅头酒，北京皇家京都酒业有限公司。无水乙醇，天津市大茂化学试剂厂。E.Z.N.A.Tussue RNA Kit总RNA 抽提试剂盒，OMEGA BIO－TEK。RT－PCR 二步法试剂盒，宝生物工程大连有限公司。

1.2 仪器与设备 超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；JY 600 电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；MJ Research PTC 100 Thermal Cycler（Waltham，MA，USA）。

1.3 动物与分组 Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠50只，体重200g～220g，由郑州大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（豫）2005－0001。所有大鼠在23 ℃～25 ℃室内饲养，自由饮水或饮酒，自由摄食。动物随机分为对照组（C 组）、酒精组（A 组）、维生素C组（V 组）、牛磺酸组（T 组）、牛磺酸＋维生素C组（TV 组），每组10只。C 组大鼠自由饮水、自由摄食20周；其余各组大鼠以酒代水自由饮用［第1周为10%（V／V）酒精，之后给予20%（V／V）酒精19周，共20周］；V 组大鼠在饮酒同时加0.05%维生素C；T 组大鼠在饮酒同时加2%牛磺酸；TV组大鼠在饮酒同时加2%牛磺酸和0.05%维生素C。

1.4 指标测定 实验进行20周末，将各组大鼠处死，取前脑。右半脑置于10%中性甲醛溶液中固定48h，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜下观察脑组织形态学改变。左半脑置－80 ℃低温冰箱中，备测定脑组织NCX1mRNA 表达。

取100mg脑组织按试剂盒说明抽提总RNA，取3μg行RT－PCR反应引物按Genebank所提供的基因序列设计，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

NCX1前引物：5′－GCGATTGCTTGTCTCGGGTC－3′，后引物：5′－CCACAGGTGTCCTCAAAGTCC－3′，产物为230bp。内参GAPDH 前 引 物：5′－TCCTGCACCACCAACTGCTTAG－3′，后 引 物：5′－GATGACCTTGCCCACAGCCTTG－3′，产 物 为208bp。NCX1的扩增条件：95 ℃2min，然后94 ℃30s，60 ℃30s，72 ℃40s（30个循环），72 ℃延伸10min。内参GAPDH的扩增条件：94℃2min，然后94℃45s，59℃45s，72℃45s（30个循环），72 ℃延伸10min。产物进行电泳和拍照，扫描条带灰度，以GAPDH 作为内参，作半定量分析。NCX1 mRNA相对量＝NCX1条带灰度值／GAPDH 条带灰度值。

2 结 果

2.1 牛磺酸、维生素C 及二者合用对长期饮酒大鼠脑组织形态学改变的影响 对照组大鼠脑组织切片在光镜下表现为正常神经元，胞体突起明显，胞质内可见尼氏体，细胞核圆形，染色浅、亮，核仁明显。酒精模型组大鼠脑组织可见大量神经元体积缩小，呈三角形或扇形，核固缩深染，核内染色质浓聚，染色质浓集于核周，呈新月形、环形、长条形、块状小体甚至形成核碎片。单用牛磺酸或维生素C 对脑组织形态学改变有一定的改善作用，可见部分神经元核固缩，突起回缩，核内染色质浓聚。有血管增生、扩张，内可见炎性细胞。牛磺酸与维生素C 合用使大鼠脑组织形态学改变明显较酒精模型组改善，大多数神经元结构正常，少数神经元出现胞体肿胀，染色浅。

2.2 牛磺酸、维生素C 及二者合用对长期饮酒大鼠脑组织钠钙交换mRNA 表达的影响 与对照组相比，酒精组大鼠脑组织中NCX1mRNA 表达量减少，但差异无统计学意义（P＞0.05），牛磺酸及其合用维生素C 使大鼠脑组织中NCX1mRNA 表达量显著增加（P＜0.01）。与酒精模型组比较，牛磺酸及其合用维生素C显著增加了大鼠脑组织中NCX1mRNA 表达量（P＜0.01）。详见图1。

图1 牛磺酸、维生素C及二者合用对长期饮酒大鼠脑组织中NCX1mRNA 表达的影响

3 讨 论

钠钙交换体是广泛存在于心、脑、血管平滑肌、骨骼肌等多种可兴奋细胞中的一种膜蛋白，大脑中NCX 的三种亚型都有表达，对调节细胞内Ca2＋浓度有重要的作用，在神经的钙循环中起着非常重要的作用，是内钙消除的主要机制［8］。近年来，随着NCX 的特异性抑制剂被不断发现和合成，将NCX 作为治疗脑血管疾病的靶点也被重视起来［9，10］。

本实验脑组织形态学观察结果显示，长期饮酒可导致大鼠脑组织神经元损伤，牛磺酸单用对该损伤有一定的改善作用，合用维生素C 能进一步保护大鼠酒精性脑损伤脑组织神经元。同时，实验结果显示，长期饮酒对大鼠脑组织钠钙交换mRNA的表达量与正常对照组比较有减少趋势，单用牛磺酸及其与维生素C合用能显著增加长期饮酒大鼠脑组织钠钙交换mRNA的表达量。表明牛磺酸及其与维生素C 合用可能通过上调大鼠脑组织钠钙交换mRNA 的表达，促进神经细胞内的Ca2＋外排，减轻酒精导致的神经细胞钙超载，保护脑组织。

当然，牛磺酸和维生素C 均为作用明确的抗氧化剂，有实验表明［11］，牛磺酸通过抗氧化的途径来减轻酒精对肝脏导致的损伤，不同浓度维生素C能提高血管的抗氧化功能［12］。牛磺酸合用维生素C对大鼠酒精性脑损伤脑组织的保护作用也可能通过其抗氧化作用产生。

本研究提示，牛磺酸与维生素C 合用对长期饮酒对大鼠脑组织损伤具有保护作用，上调钠钙交换mRNA 的表达可能是其作用机制的一个方面。牛磺酸合用维生素C 对钠钙交换是否有直接作用，亦或是其通过抗氧化作用产生的，还需要进一步的实验研究。

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