缺血预处理联合黄芩苷预处理对大鼠脑缺血再灌注半暗带细胞凋亡及Bcl－2／Bax比值的影响1）

谭丽丽，杨向方，李燕广，张国徽

迟发性神经元损伤是脑缺血再灌注损伤的重要环节，细胞凋亡与其有一定相关性。黄芩苷是中药黄芩的重要单体化合物成分，具有传统意义上的清热解毒、抑菌抗炎、利胆、降压、利尿、抗变态反应等生物活性，近年来发现黄芩苷对大鼠脑缺血再灌注损伤具有一定作用［1，2］。神经细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤的重要环节。Bcl－2／Bax比值与细胞凋亡调控有关。本研究通过观察黄芩苷对局灶性脑缺血再灌注后缺血半暗带神经细胞凋亡和Bcl－2／Bax比值的影响，以探讨其可能的脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性Sprague－Dawley（SD）大鼠150只，体重270g±20g，SPF／UAF 级，购自北京大学医学部实验动物科学部，许可证号：SCXK（京）2008－0010。称重后随机将大鼠分成5组：假手术组、模型组（缺血再灌注组）、缺血预处理组、黄芩苷预处理组、缺血预处理联合黄芩苷预处理组（联合预处理组），每组30只。除假手术组外，各组均缺血2h，再灌注12h、24h、72h。

1.2 药物与试剂 黄芩苷购自上海源叶生物科技有限公司（型号90016，规格每支20mg）。黄芩苷预处理组采用灌胃法给药，每日早晨给药1次，连续给药7d，最后1次给药后1h实施脑缺血再灌注手术；给药剂量按大鼠与人体表面积等效剂量折算。黄芩苷剂量为100mg／（kg·d）。联合预处理组即在缺血预处理同时连续灌胃给药7d。假手术组和模型组动物自手术日前7d开始给予等量去离子水灌胃。观察各组大鼠术毕清醒后的Longa评分和术后的活动度变化。栓线购自北京沙东生物技术有限公司。

1.3 动物模型制备 采用改进Longa线栓法［3］制备大鼠右侧大脑中动脉脑缺血再灌注模型（MCAO）。缺血预处理：阻断右侧大脑中动脉10min，再灌注24h，7次后与其他组分别取材。其他各组SD 大鼠术前24h禁食，随意进水。用7%水合氯醛（350mg／kg）腹腔注射麻醉，不结扎翼颚动脉，均缺血2h，术后单笼、分组给药。假手术组颈部切口暴露颈外动脉，不插线，其余步骤同实验组。动物清醒后采用Longa评分标准进行神经功能评分（0分：无神经功能缺损表现；1分：对侧前爪不能充分伸展；2分：行走时向外侧转圈；3分：行走时向对侧倾斜；4分：不能行走，意识丧失），1分～3分者纳入实验，不符合模型判断标准的动物剔除。

1.4 动物灌注固定与取材 将实验大鼠缺血2h，至再灌注所需时间点时，7%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛200mL（4 ℃）心脏灌注固定30min。快速断头取脑，从前向后将脑组织分为A、B、C、D、E五等分，切成厚度2mm～3mm 的脑片，选取C脑片，入4%多聚甲醛固定液中继续固定24h。

1.5 切片制备及HE 染色 常规乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度4μm，4 ℃储存备用。HE染色观察病理形态。1.6 脑神经细胞凋亡检测 采用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的地高辛dUTP缺口末端标记法（TUNEL）来识别凋亡细胞。试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司（产品批号：10090522）。

1.7 Bcl－2／Bax比值测定 SP法检测，阴性对照用0.01mol／L PBS（pH 7.4）代替一抗。免疫组织化学法采用SP法，操作严格按说明书进行，DAB 显色，常规脱水、透明、封片。抗体及试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司（PV－6001 批号：K92708D）。抗体稀释液：ZL1－9029，批号：546892A。

2 结 果

光镜下（×400）细胞核内存在棕黄色颗粒者为凋亡细胞。在梗死周边区域随机选取10个互不重叠视野，计数阳性细胞。各时间点模型组细胞凋亡数及Bcl－2／Bax比值明显高于假手术组（P＜0.05）；与模型组比较，缺血预处理组、黄芩苷预处理组均可明显降低MCAO大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡（P＜0.05），而Bcl－2／Bax比值升高，缺血预处理联合黄芩苷预处理组效果尤为显著（P＜0.05）。详见表1、表2。

表1 缺血预处理联合黄芩苷预处理对MCAO 大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡的影响

表1 缺血预处理联合黄芩苷预处理对MCAO 大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡的影响

与假手术组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与缺血预处理组、黄芩苷预处理组比较，3）P＜0.05

组别 n 12h 24h 72h假手术组 30 0.80±0.12 1.00±0.60 0.90±0.27模型组 30 37.50±3.181） 51.60±2.471） 7.40±1.201）缺血预处理组 30 29.80±2.05 44.50±3.10 5.50±1.00黄芩苷预处理组 30 31.20±1.921）2） 43.40±1.061）2） 5.50±1.201）2）联合预处理组 30 13.10±1.101）2）3）27.10±0.591）2）3）4.00±1.101）2）3）

表2 缺血预处理联合黄芩苷预处理对MCAO 大鼠缺血半暗带Bcl－2／Bax比值的影响

表2 缺血预处理联合黄芩苷预处理对MCAO 大鼠缺血半暗带Bcl－2／Bax比值的影响

与假手术组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与缺血预处理组、黄芩苷预处理组比较，3）P＜0.05

组别 n 12h 24h 72h假手术组 30 0.47±0.80 0.47±0.20 0.47±0.50模型组 30 0.43±0.301） 0.36±0.201） 0.41±0.101）缺血预处理组 30 0.49±0.121） 0.52±0.021） 0.51±0.141）黄芩苷预处理组 30 0.52±0.101）2） 0.53±0.131）2） 0.53±0.061）2）联合预处理组 30 0.64±0.121）2）3）0.66±0.021）2）3）0.76±0.131）2）3）

3 讨 论

缺血性脑血管病目前已成为威胁人类生命的最主要疾病之一［4］。近年来，关于中药复方治疗中风的研究进展大量涌现，中药单体对疾病的治疗作用逐步被揭示。既往研究表明，黄芩苷可明显降低脑缺血－再灌注损伤所致的神经细胞凋亡率，对大鼠局灶性脑缺血－再灌注损伤具有保护作用［5］。

脑缺血半暗带的神经细胞凋亡与疾病转归相关［6］。细胞凋亡是细胞为维持其内稳态的自主程序性死亡（programmed cell death，PCD）。抑制缺血后神经细胞凋亡对保护神经元具有一定作用。细胞凋亡的机制与凋亡基因表达相关，即抗凋亡基因和促凋亡基因的表达。Bcl－2、Bax基因是目前研究较明确的一对在功能上相互对立的凋亡调控基因，其表达的Bc1－2和Bax蛋白对神经元凋亡具有调控作用［7］。

Bcl－2蛋白家族主要分布于线粒体、内质网和胞核的外膜［8］，是一组细胞凋亡调控蛋白。根据其作用分为两类：一类为抗凋亡蛋白，如Bcl－2蛋白；另一类为促凋亡蛋白，如Bax蛋白。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之间相互拮抗［9］。Bcl－2蛋白能够抑制Bax蛋白启动的凋亡机制。而Bax蛋白作为Bcl－2蛋白家族的促凋亡成员，可以不依赖于激活或抑制其他相关基因而诱导细胞凋亡。细胞是否进入凋亡程序决定于Bcl－2蛋白和Bax蛋白的相对值，Bcl－2／Bax比率改变与神经元凋亡密切相关。以往研究显示脑缺血再灌注后Bax蛋白表达明显增加，且Bax阳性反应位于TUNEL 阳性的细胞内，其时间与空间的分布与TUNEL阳性神经元一致。既往研究表明，细胞受刺激后Bcl－2／Bax的比值越高，细胞存活率越高，细胞凋亡率越低。Bcl－2／Bax比值的转变，可能调控了神经元的凋亡。

本研究结果发现脑缺血再灌注后，缺血再灌注组大鼠神经细胞凋亡数目、Bcl－2／bax比值均明显高于假手术组；缺血预处理对脑缺血再灌注具有很好的改善作用，降低凋亡率，升高Bcl－2／bax比值。本研究结果显示，缺血预处理联合黄芩苷预处理可上调脑缺血再灌注诱导的Bcl－2 蛋白表达，同时下调Bax蛋白表达，使Bcl－2／Bax比值升高，可能促使Bcl－2、Bax异源二聚体形成，抑制细胞凋亡；脑神经细胞凋亡减少，Bcl－2／Bax比值明显高于缺血再灌注组，说明缺血预处理联合黄芩苷预处理可能通过抑制脑神经细胞凋亡，达到保护缺血半暗带目的，从而起到保护大鼠局灶性脑缺血再灌注的作用。

综上所述，缺血预处理联合黄芩苷预处理可明显减少MCAO 模型大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡，其机制可能与提高Bcl－2／Bax比值有关，可能是其促进神经元的修复及重塑的机制之一。

［1］ 刘萍，张岫美，王菊英，等.黄芩苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中国药学杂志，2007，42（10）：743－748.

［2］ 张占军，汪丽娅，王忠，等.黄芩苷、栀子苷及其配伍治疗局灶脑缺血大鼠药效评价及作用机制研究［J］.中国中药杂志，2006，31（11）：907－910.

［3］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84－91.

［4］ Diener HC，Katsarava Z，Weimar C.Headache associated with ischemic cerebrovascular disease［J］.Rev Neurol，2008，164（10）：819.

［5］ 刘萍，王菊英，李倩，等.黄芩苷对脑缺血－再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡及相关基因表达的影响［J］.中国新药与临床杂志，2007，26（2）：109－114.

［6］ Jiang H，Wang MX，Guo J，et al.The midnight－noon ebb－flow point selection for 30cases of acute ischemic cerebrovascular diseases［J］.J Tradit Chin Med，2008，28（3）：193.

［7］ Sinn DI，Kim SJ，Chu K，et al.Valproic acid－mediated neuroprotection in intracerebral hemorrhage via histone deacetylase inhibition and transcriptional activation［J］.Neurobiol Dis，2007，26（2）：464－472.

［8］ 金华，孙抒，于柏艳，等.蛴螬提取物对MCF－7人乳腺癌细胞株凋亡的影响［J］.中国病理生理杂志，2008，24（1）：93－96.

［9］ 黄丽素，张捅军，何柳芳，等.铜诱导神经元凋亡及凋亡相关蛋白的表达［J］.上海交通大学学报（医学版），2007，27（10）：1193－1196.