多肽类药物的氨基酸检测方法

王丽莉

摘 要：多肽类药物的氨基酸组分测定步骤：多肽的水解方法→衍生→HPLC检测。简述多肽药物的水解方式及衍生方法。

关键词：氨基酸组分；柱前衍生法；多肽药物

多肽类药物是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键、二硫键连接成一长链或环状结构，常具备α螺旋、β折叠或不规则卷曲的二级结构。多肽的一级结构决定了药物的高级结构及功能。分析多肽类药物的氨基酸组成是进行多肽类药物结构确证不可缺少的部分。氨基酸组成分析的步骤：多肽的水解方法→衍生→HPLC检测。

1 多肽的水解方法

虽然多肽的氨基酸组成分析方法较多，且趋向更灵敏、更精确、更简便、更快速，但还没有一种方法可以单独适用于所有氨基酸残基的检测，并且很多因素如温度、时间、水解试剂、水解方法及多肽样品中添加剂等对水解程度均有影响。常用的水解方法作简要介绍如下：

1.1 酸性水解[1]

酸性水解是应用最为广泛水解方法，可以使大多数氨基酸残基完全水解，最通用的水解剂是6 mol/L HCl。

条件：6 mol/L HCl、真空、110℃，水解时间为20～24h。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。但在该条件下，天冬酰胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸先用二硫代二丙酸、4-乙烯吡啶或碘代乙酸保护后水解方可测定，酪氨酸部分被水解液所破坏，丝氨酸和苏氨酸被部分水解。有些脂肪族氨基酸残基间的肽键难于裂解，可以通过延长水解时间如水解92h甚至120h来解决。

1.2 碱性水解

碱性水解一般选用NaOH和KOH作为水解剂。该水解方法是HCl水解的互补法。因为碱水解时，多数氨基酸遭到破坏或外消旋化，仅色氨酸是稳定的。所以此法仅限于测定色氨酸。

1.3 酶水解

用一组蛋白酶水解肽链，特别适用于对化学水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可以保持所有的组成氨基酸不被破坏。但是因为酶水解条件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作用，且反应需要较长的时间，水解不完全，酶本身也是蛋白质，对样品的测定结果可能会有干扰。

微波辐射能水解，一般情况下190℃微波水解15分钟肽类即可完全水解，导致完全水解的时间大大缩短。在微波辅助酸水解和微波辅助酶水解中，水解时间可从过去的几十小时缩短到几十分钟。

总之，多肽药物水解方式应根据其产品的性质、研究目的、可获得的样品量及少实验室的具体条件采取适宜的水解方法。

2 衍生

从衍生角度看，氨基酸分析可以分为柱后反应法和柱前衍生法两大类。

目前肽类的氨基酸衍生主要以柱前衍生为主。将游离氨基酸经过色谱柱分离后，各种氨基酸再与显色剂（茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛）作用。此法比较稳定，对样品预处理要求低，容易定量和自动化操作，但检测灵敏度不高，分析时间长。

2.1 柱前衍生法

将氨基酸和化学偶联试剂先反应生成氨基酸的衍生物，然后再用色谱柱将各种衍生物分离，直接检测衍生物的光吸收或荧光发射。此法可检测OPA-（邻苯二甲醛），FMOC，PITC，AQC，DNFB，Dansyl-氨基酸，分析灵敏度高，可利用HPLC进行氨基酸分析，有的衍生物不稳定，衍生试剂可能干扰氨基酸检测。

多肽药物的氨基酸组分分析大多数采用柱前衍生。

2.2 PITC柱前衍生氨基酸分析法[2]

本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为0.025～1.25？滋mol/ml，本法检验操作比较复杂。

2.3 AQC柱前衍生分析法

本法系根据氨基酸与6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）反应，生成有紫外与荧光响应的不对称尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸经反相高效液相色谱后用紫外或荧光检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为2.5～200nmol/ml。

2.4 OPA和FMOC柱前衍生氨基酸分析法

一级氨基酸与邻苯二醛（OPA）反应，生成在338nm波长下有吸收的OPA-氨基酸；二级氨基酸与FMOC反应，生成在262nm波长下有吸收的FMOC-氨基酸，生成的氨基酸衍生物通过高效液相色谱分离后用紫外或荧光检测。

2.5 DNFB柱前衍生氨基酸分析法

本法系根据氨基酸与2，4-二硝基氟苯（DNFB）反应，生成有紫外响应的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸经反相高效液相色谱分离后采用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性响应范围为30～140 pmol。除另有规定外，一般不宜采用本法。

2.6 Dansyl-Cl（DNS-Cl）法

荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）能与所有氨基酸柱前反应形成高稳定性的带有荧光的DNS-氨基酸。但反应耗时。

3 结束语

总之，肽类的氨基酸测定可以采用不同的水解方式，采用适宜的衍生方法经行测定，另外随着质谱技术的广泛应用，可以采用质谱法测定肽类物质的氨基酸序列，不但可以判定肽类的氨基酸组成还可判定其氨基酸的链接顺序，使肽类氨基酸的检测更准确，对肽类物质的结构确证更具意义。

参考文献

[1]赵成仕，臧爱香，夏莲.酸水解-全自动氨基酸分析仪测定蜂蜜中17种氨基酸[J]. 现代农业科技，2013年03期.

[2]吕莹果，张晖，孟祥勇.氨基酸测定及衍生方法[J].粮食与油脂，2009年第07期.