iPSCs遗传稳定性与重编程机制的研究进展

任才芳，孙红艳，王立中，张国敏，樊懿萱，颜光耀，王丹，王锋

南京农业大学，江苏省家畜胚胎工程实验室，南京 210095

Jiangsu Livestock Embryo Engineering Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

iPSCs遗传稳定性与重编程机制的研究进展

任才芳，孙红艳，王立中，张国敏，樊懿萱，颜光耀，王丹，王锋

南京农业大学，江苏省家畜胚胎工程实验室，南京 210095

诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)是采用特定转录因子，将体细胞重编程为具有多能性的干细胞。iPSCs已成功由多种体细胞诱导出来，不仅具有发育多能性还能避免胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)的伦理道德问题，已成为生命科学领域不可或缺的研究工具，具有广阔的应用前景。但获得高质量、遗传稳定的iPSCs是当前亟须解决的问题。文章对iPSCs重编程机制和遗传稳定性的研究进展进行了综述，以期为提高iPSCs的诱导效率、降低诱导成本、掌握iPSCs质量控制的关键点提供参考，从而推进多能性干细胞临床应用的发展。

iPSCs；遗传稳定性；重编程机制；表观遗传学

早在1981年，Evans和Kaufman[1]就利用囊胚内细胞团首次建立小鼠胚胎干细胞系，因其具有全能性和无限增殖的特性在组织修复等方面蕴藏着巨大应用潜力而受到广泛关注，并引发了后续的干细胞研究热潮。但事实上，胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)建系非常困难，迄今只有在小鼠[1]、大鼠[2]、人[3]和猴类[4,5]上建系，而且其应用一直受阻于伦理道德(以破坏早期胚胎为代价)和异体排斥等问题的困扰。

直到2006年，Takahashi等[6]首次报道从小鼠体细胞获得了诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)，这为干细胞研究和应用带来了重大变革。将转录因子 Oct3/4、Sox2、Klf4和 c-Myc (OSKM)导入体细胞使其重编程为具有多能性的一类干细胞——iPSCs[6]。iPSCs具有无限自我更新的能力和分化为 3个胚层细胞的多能性，已成为生命科学领域一个重要的研究工具。这项技术不仅简化了去分化重编程的研究方法，也为再生医学的细胞移植治疗[7]、疾病模型的构建[8]以及哺乳动物的发育研究[9]等提供了新的方法和手段。

理论上，所有体细胞均可重编程为iPSCs，但目前已诱导过的体细胞重编程效率均比较低。通过从形态学、基因表达模式和分化为3个胚层细胞能力等方面的研究发现，尽管iPSCs与ESCs在功能和分子结构等方面的总体参数类似[10]，但仍存在各方面不同程度的差异，包括特异的表观遗传修饰[11]、基因表达[12]、分化潜能[13]和疾病模型的变异[14]等，不仅影响iPSCs的遗传稳定性，而且诱导的iPSCs可能会致瘤。因此，重编程的低效、不明确的重编程机制以及诱导后的 iPSCs的遗传不稳定现象等问题严重限制iPSCs的应用。本文综述了iPSCs的形成机制、遗传稳定性的最新进展，并推测了调控iPSCs质量鉴定的关键点，旨在为多能性干细胞的研究和应用提供参考。

1 iPSCs的诱导优化

iPSCs诱导效率低以及病毒转基因的整合是长期困扰其发展的重要因素。为提高 iPSCs的诱导效率和质量，简化诱导过程，提高其安全性，科研人员正不断地对诱导体系进行优化。

在诱导方法方面，除早期的4因子外，根据不同的动物可对多能因子进行增减实验，如Bao等[15]研究发现，仅用OSKM诱导出的绵羊iPS样细胞不能稳定传代，而在这4个转录因子基础上增加Nanog、 Lin28、SV40 large T和hTERT诱导出了稳定的绵羊iPS细胞系，能传至30代以上。鉴于iPSCs的安全性问题，很多学者都在探索多能性基因诱导重编程的代替方法，为避免病毒转基因重组导致 iPSCs基因组的突变。Warren等[16]利用体外合成的编码OSKM的mRNA诱导出iPSCs，不仅将诱导效率提高十倍，而且成功建立一个简单、高效、安全非整合的iPSCs诱导体系。最近，Hou等[17]开创性地利用7种小分子化合物成功诱导了小鼠iPSCs (Chemically induced pluripotent stem cells, CiPSCs)，效率达到0.2%，这与慢病毒诱导的效率相当，他们还通过多种方法验证了CiPSCs的多能性，由其生产的6月龄嵌合体小鼠 100%健康存活。这种化合物诱导iPSCs的方法不仅避免了病毒诱导的 iPSCs的致癌危险，而且使 iPSCs离临床应用更近一步，这在体细胞重编程进程中具有里程碑的作用。

在培养条件方面，Miguel等[18]在培养基中添加Vitamin C不仅提高了重编程效率，还改善了小鼠iPSCs(Mouse iPSCs, miPSCs)质量。目前，小鼠[19]和人[20]的iPSCs已成功实现了无饲养层培养。David等[19]在无血清和无饲养层的悬浮培养环境下诱导出miPSCs，加速了由单个细胞和较少细胞生产 iPSCs的进程，促进了 iPSCs的诱导、扩增与分化技术的发展。最近，Nakagawa等[20]发现StemFitTM培养基结合重组Laminin-511 E8片段能使人类ESCs(Human ESCs, hESCs)和人类iPSCs (Human iPSCs, hiPSCs)在培养皿上稳固生长，且能消化成单细胞传代而无核型异常现象。人的 iPSCs无饲养层培养体系避免人iPSCs带有动物源成分，简化了安全性测试过程，增加了安全性更高的iPSCs数目。

iPSCs在诱导优化方面已经取得了一系列突破性的进展，但迄今产生的多种 iPSCs仍存在很多遗传不稳定现象。

2 iPSCs的遗传稳定性

iPSCs的遗传稳定性因直接影响到其质量和应用而备受关注。通过对多个 iPSCs基因组异常现象的分析表明，从染色体、基因拷贝数以及单核苷酸到线粒体DNA都存在发生畸变的趋势。这些遗传畸变可能由多种原因导致：(1) 原始细胞的突变在重编程过程中一直携带；(2) 转录因子及基因重组导致的突变；(3)细胞传代培养时出现新的突变并积累；(4) iPSCs本质性更高的变异率。具体见表1。

2.1 染色体畸变

Taapken等[21]对大量研究分析发现 12.5%的iPSCs系存在染色体畸变，相比于ESCs系的分析结果无显著性差异，而且iPSCs系倾向于获得与ESCs系类型相似的染色体畸变。[21-23]。

iPSCs中部分染色体畸变可能来源于体细胞，它们在诱导过程中保留下来，但是染色体畸变增加似乎与重编程方法或体细胞种类无关[21～25]。

多个研究报道认为，iPSCs的传代次数与染色体畸变存在相关性联系。通过观察畸变出现的时间，可以发现iPSCs更倾向于在低代次出现染色体畸变，峰值在 8代左右，而ESCs似乎在高代次(＞30代)才积累产生染色体畸变[22,24,25]。进一步分析拷贝数变异(Copy number variations, CNVs)，iPSCs的CNVs大多数出现在低代次并在传代过程中减少；而 ESCs的CNVs数量相当稳定[24]。Hussein等[26]则认为，诱导过程本身可能会导致CNVs 的显著增加，以致诱导产生的iPSCs具有大量新生CNVs。因此，iPSCs畸变发生在其生长的起始阶段可能性最大，而且可能主要由重编程过程的选择所致。Alexej等[27]通过对7个个体、20个hiPSCs系进行全基因组和转录组分析，发现在 iPSCs中表现出来的这些变异中至少有 50%在亲代中低频出现，因此重编程不一定是导致iPSCs产生新的畸变的原因。有研究表明，iPSCs诱导过程能够掩盖体细胞的染色体不稳定性，说明重编程过程可能对非整倍体细胞具有选择作用[28]。

表1 iPSCs遗传稳定性的研究总结

2.2 单核苷酸突变

每个iPSCs系均携带了1000多个单核苷酸突变，但某些突变并不能在原始体细胞中检测到，说明它们可能是iPSCs重编程时变异所致[29,30]。Ji等[29]对不同代次细胞进行测序，揭示iPSCs大约有7%的突变是在传代过程中产生的，19%存在于原始体细胞中，而74%是在重编程过程中获得的。

仔细观察 iPSCs单核苷酸突变产生的时间，可以鉴别突变发生在重编程之前还是刚刚重编程之后，但为了充分阐明诱导多能性细胞的特性，最主要的还是要鉴定iPSCs是否比ESCs和体细胞更倾向于发生单碱基突变。

2.3 端粒的完整性

端粒是线状染色体末端的DNA重复序列，在正常体细胞中，其长度随着细胞分裂而逐渐缩短。iPSCs是由完全分化的细胞诱导产生的，所以重编程必须使端粒延长，以使其能够无限地自我更新。虽然在重编程后一般仍能观察到端粒在延长，但iPSCs克隆之间端粒的长度似乎相差很大，有报道认为端粒长度在培养过程中随时间延长而缩短[36]。为了直接验证端粒酶在iPSCs重编程过程中的作用，Wang等[37]对比了Terc杂合(+/-)和Terc缺陷(-/-)小鼠尾尖成纤维细胞的重编程效率，虽然这两类细胞均能诱导出iPSCs，但将Terc(-/-)iPSCs注射到8细胞胚胎中没有产生嵌合体后代，表明(1)端粒酶可能是诱导多能性所必须的；(2)Terc(-/-)iPSCs不能产生嵌合体，可能与其端粒长度严重缩短、长期增殖能力变弱有关。此外，端粒延长与DNA甲基化的改变相关，但iPSCs克隆间 DNA甲基化差异大，Yehezkel等[38]提出TERRA水平升高可能对稳定iPSCs端粒长度和功能具有重要作用。

端粒长度是重编程的一个重要特征。即使在能观察到其他多能性参数的情况下，若端粒不完全的延伸，甚至随着时间的推移，端粒缩短均可能为不完全重编程，这可能是某些 iPSCs克隆不能传代、突然衰竭的原因。

2.4 线粒体DNA

不同 iPSCs间遗传稳定性存在大量差异，最近对线粒体DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)分析也发现，在重编程过程中mtDNA存在各种变化，但在iPSCs系间并没有检测到显著的代谢差异。因此，mtDNA多拷贝数与高变异的特征可能导致细胞对基因突变的耐受性增强，但具体影响和机制尚需要进一步研究[39]。

3 iPSCs的重编程机制研究

iPSCs的诱导技术已经成熟，但其机制尚不明确。多能性的重编程机制对提高重编程的效率和获得高质量重编程细胞具有重要影响，深入了解重编程机制将有助于阐明细胞稳定特性的机制，指导细胞分化，推进 iPSCs在个性化治疗中的应用。目前，对重编程的了解虽然有所进展，但仍不够透彻，归纳起来主要从两个方面探讨 iPSCs重编程机制：一是重编程过程中内源和外源信号通路对体细胞去分化的影响，另一方面则倾向于表观遗传修饰对 iPSCs形成的调控。

3.1 iPSCs信号通路研究

重编程诱导的关键问题就是体细胞状态如何被消除，干细胞样转录网络如何形成。诱导有效的重编程需要经历很多步骤，首先是形成干细胞样克隆，但大多数表达重编程因子的细胞未能成功发生形态变化，仍保持成纤维样即发生凋亡、衰老或细胞周期停滞；其次是形成干细胞样转录网络，逐渐消除体细胞状态；最后是干细胞样克隆如何获得和维持干性(全能性)。Sharma等[40]研究通过调控重编程过程中信号通路关键因子的反应，进而获得更高的重编程效率。研究发现，p53/p21或 Ink4a/Arf的沉默可提高iPSCs的生产效率，其中抑制p53/p21途径能提高细胞增殖率，加速 iPSCs形成[41]。SIRT6是维持转录、基因组稳定、端粒完整性、DNA修复和代谢稳态的关键调控因子，能显著提高重编程效率[40]；外源多能性基因诱导体细胞重编程通常是一种低效且随机的事件，Tanabe等[42]发现大多数人皮肤成纤维细胞在接受到 OSKM信号后能启动重编程过程，但之后有很多细胞逆转重编程，导致重编程效率较低，研究表明在之前报道的能提高直接重编程效率的因子中，只有LIN28而非Nanog、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)或p53 shRNA显著抑制了重编程的逆转。这些研究表明，在人成纤维细胞重编程过程中，是成熟过程而不是启动过程限制了重编程。细胞类型特异性剪接模式对细胞的特性与功能具有重要作用，深度测序结合高通量绝对定量技术发现，在重组期间，体细胞剪接模式也恢复到多能性状态。利用siRNA筛选鉴定了调节iPSCs剪接模式的关键基因U2af1和Srsf3，结果表明它们在体细胞重编程过程中具有重要作用[43]，剪接模式的选择可能代表了重编程的部分分子网络。Hou等[17]仅利用小分子化合物成功诱导出miPSCs，其中人类婆罗双树样基因-4(Sal-like4, Sall4)介导的分子通路在小分子化合物诱导重编程的早期发挥着重要作用。

3.2 iPSCs表观遗传调控

诱导多能性是一个伴随着表观遗传学逐渐变化的过程，如重编程过程中外源基因的沉默[44]，内源多能性基因的重新激活[6]，基因启动子的二价染色质域的建立[45]，染色质纤维重组[46]等。下文主要从组蛋白修饰、DNA甲基化与去甲基化以及其他表观修饰形式等方面阐述多能性诱导过程中表观修饰特性如何形成以及它们对维持多能性的作用。

3.2.1 多能性细胞独特的组蛋白修饰

随着分子生物技术的发展，如今已经能够在全基因组水平描绘出染色体表观遗传模式。研究发现，多能性干细胞拥有特殊的组蛋白修饰模式。

多能性细胞独特的组蛋白修饰受两个重要因素影响：一是 PcG(Polycomb group)蛋白，其介导的H3K27甲基化能抑制多能性干细胞中发育调节因子的表达；二是TrxG(Trithorax group)蛋白，其介导的H3K4甲基化能够激活自我更新相关基因的表达。Mansour等[47]发现H3K27甲基转移酶Utx参与调节iPSCs的诱导效率，与多能性的维持无关。Utx利用其组蛋白脱甲基催化作用，与OSK一起加速iPSCs的形成。H3K4的甲基化由TrxG成员介导， TrxG的主要成员Wdr5在未分化的ESCs和iPSCs中表达最高，随着细胞分化，其表达水平下降。Wdr5与Oct4相互作用，为iPSCs有效形成所需，Wdr5表达沉默会导致Oct3/4靶基因表达下降、ESCs自我更新能力降低[48]。H3K4去甲基化酶 LSD1 能与Rcor家族辅阻遏蛋白形成复合体发挥稳定甲基化的作用，共表达Rcor2与Oct4、Sox2和 Klf4 能促进iPSCs的形成[49]。组蛋白的乙酰化也是多能性干细胞中重要的组蛋白修饰模式。乙酰化水平通常与转录活性相关，由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的调节维持平衡。HAT复合物如Gata4和 Gata6是 ESCs发育的调控因子，而且明显与Nanog的靶基因重叠。另外，HDAC抑制剂如丙戊酸[50]能提高 iPSCs的重编程效率，表明组蛋白乙酰化参与多能性的获得与维持。

3.2.2 DNA甲基化和去甲基化

在iPSCs中观察到的DNA甲基化能表现其来源体细胞的特征，暗示表观遗传记忆的存在[51]。

Shao等[11]通过对比人类骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)、ESCs和由MSCs诱导的iPSCs的DNA甲基化模式发现，iPSCs携带体细胞的表观遗传记忆，并且其甲基化模式与ESCs相似，但iPSCs的DNA甲基化通常在CpG岛外，而且主要发生在参与分化的基因。有研究表明，非CpG的胞嘧啶DNA甲基化可能与其精确性有关[52]。为探索多能性干细胞逆转衰老是否伴随着特定的衰老相关DNA甲基化，Koch等[53]对比间充质干细胞在长期培养、红外辐射、永生化和诱导为 iPSCs 4种过程的DNA甲基化的变化，结果表明长期培养与表观遗传调控相关，电离辐射不会影响衰老相关的DNA甲基化，过表达人端粒酶催化亚基或用强力霉素诱导细胞的永生化能延长端粒却不能避免衰老相关的DNA甲基化，只有iPSCs几乎避免了全部的衰老相关的 DNA甲基化。这表明 iPSCs中衰老相关DNA甲基化相对较少，可能在它们恢复干性、逃避细胞衰老的过程中发挥重要的作用。

在重编程过程中，内源多能性基因(包括Oct3/4和Nanog)的激活伴随着其启动子区域胞嘧啶的去甲基化，多能性基因启动子区域的DNA去甲基化不足，会导致其不能被激活[54]。Tet(Ten-eleven translocation, Tet)蛋白能够催化 5-甲基胞嘧啶(5-mC)转化为 5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)，参与DNA去甲基化，对重编程具有重要的调节作用[55]。

3.2.3 其他的表观调控

最近，中美科学家联合攻关发现了 iPSCs形成过程中的一个关键“路障”——细胞内的染色体构象，研究结果表明，体细胞仅有4个转录因子不足以形成完全多能性干细胞，还取决于另一个关键因素，即SMC1(Structural maintenance of chromosomes 1)蛋白介导的染色体三维内环构象[56]。

X染色体失活(X chromosome inactivation, XCI)也具有一定的调控作用。mESCs携带两条活性染色体(XaXa)，随着这些细胞的分化会启动 XCI，即其中一条X染色体失活，从而平衡雄性动物(XY)和雌性动物(XX)X相关基因的表达。研究发现重编程可以使iPSCs重新获得两条活性X染色体，但Tchieu等的研究表明某些 iPSCs仍保持着体细胞中失活的X 染色体[57,58]，这些差异可能与哺乳动物发育过程中X染色体失活起始的不同机制有关。因此，关于重编程过程中X染色体的失活与重新激活的分子机制尚需要进一步研究。

重编程是转录因子等内因和培养条件等外因共同推动的结果，在诱导 iPSCs的过程中，外源性信号与内源性信号形成复杂的调控网络共同调控iPSCs的形成。

4 iPSCs的质量监控

迄今，多项研究对 iPSCs克隆进行了形态学、AKP染色、内源与外源多能性基因的检测、畸胎瘤的形成与分析等鉴定，并由 iPSCs产生了嵌合体动物[6,17]。这些研究已充分验证iPSCs的多能性，但要生产临床级别的iPSCs，应避免慢病毒转基因的整合，保证其完全重编程，不会发生遗传不稳定现象，并使其脱离饲养层及动物源血清培养体系，最后，至关重要的是建立评定 iPSCs质量的可靠方法，这有利于筛选高质量的iPSCs进行临床应用。

外源基因整合是影响 iPSCs质量的一个重要方面。基因组的变化可能会影响 iPSCs的核型，甚至可能有致瘤危险。iPSCs中的基因组不稳定性已体现在大量的畸变中，然而，目前核型分析技术尚不能直接检测全部的变异[23]。因此，需要诸如用Array-based比较基因组杂交(Comparative genomic hybridization, CGH)、单核苷酸多态性芯片(Singlenucleotide polymorphism-based microarrays, SNP 芯片)或外显子测序等更严谨的方法来鉴定新的细胞系。在 iPSCs诱导过程中，细胞必须穿越表观遗传屏障才能成功重编程，因此，检测多能性干细胞的表观遗传模式在评定其质量方面尤为重要。由于DNA甲基化稳定而且具有长期记忆的特点，可望成为评定多能性干细胞质量的候选方法[11]。据此，也可以尝试添加甲基化抑制剂等帮助细胞穿越表观遗传屏障以提高 iPSCs的效率和质量。通过可靠的iPSCs质量评定方法，在早期鉴定细胞质量，就可以使用高质量 iPSCs培育组织和器官，这不仅有利于提高器官移植的安全性，还能降低成本。

5 展 望

iPSCs应用前景广阔，在疾病模型构建、细胞移植治疗和改善动物性能等方面具有重要作用。今后，iPSCs的培养应倾向于隔离饲养层体系，并尽量缩短培养时间以降低培养过程中累积突变的概率。在临床使用前，必须对细胞基因组完整性以及稳定性实行评估。目前，高通量测序可以在全基因组水平显示基因组的变化，通过比较iPSCs、ESCs以及体细胞的内在突变率，可以鉴定细胞是否达到临床级水平。迄今，iPSCs研究已取得了巨大的进步，但目前仍有许多问题亟待解决。最重要的是 iPSCs的重编程机制问题以及如何获得安全性更高的iPSCs。随着科学技术的不断进步和这些问题的解决，iPSCs必将为人类生命科学的发展翻开新的篇章。

[1] Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature, 1981, 292(5819): 154-156.

[2] Buehr M, Meek S, Blair K, Yang J, Ure J, Silva J, McLay R, Hall J, Ying QL, Smith A. Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts. Cell, 2008, 135(7): 1287-1298.

[3] Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 1998, 282(5391): 1145-1147.

[4] Suemori H, Tada T, Torii R, Hosoi Y, Kobayashi K, Imahie H, Kondo Y, Iritani A, Nakatsuji N. Establishment of embryonic stem cell lines from cynomolgus monkey blastocysts produced by ivf or icsi. Dev Dyn, 2001, 222(2): 273-279.

[5] Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, Durning M, Harris CP, Hearn JP. Pluripotent cell lines derived from common marmoset (callithrix jacchus) blastocysts. Biol Reprod, 1996, 55(2): 254-259.

[6] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126(4): 663-676.

[7] Robinton DA, Daley GQ. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature, 2012, 481(7381): 295-305.

[8] Urano F. Wolfram syndrome ips cells: The first human cell model of endoplasmic reticulum disease. Diabetes, 2014, 63(3): 844-846.

[9] Phillips MJ, Perez ET, Martin JM, Reshel ST, Wallace KA, Capowski EE, Singh R, Wright LS, Clark EM, Barney PM, Stewart R, Dickerson SJ, Miller MJ, Percin EF, Thomson JA, Gamm DM. Modeling human retinal development with patient-specific Induced Pluripotent Stem cells reveals multiple roles for Visual System Homeobox 2. Stem Cells, 2014, 32(6): 1480-1492.

[10] Bock C, Kiskinis E, Verstappen G, Gu HC, Boulting G, Smith ZD, Ziller M, Croft GF, Amoroso MW, Oakley DH, Gnirke A, Eggan K, Meissner A. Reference maps of human es and ips cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell, 2011, 144(3): 439-452

[11] Shao KF, Koch C, Gupta MK, Lin Q, Lenz M, Laufs S, Denecke B, Schmidt M, Linke M, Hennies HC, Hescheler J, Zenke M, Zechner U, Šaric T, Wagner W. Induced pluripotent mesenchymal stromal cell clones retain donor-derived differences in DNA methylation profiles. Mol Ther Jan, 2013, 21(1): 240-250.

[12] Laurent LC, Ulitsky I, Slavin I, Tran H, Schork A, Morey R, Lynch C, Harness JV, Lee S, Barrero MJ, Ku S, Martynova M, Semechkin R, Galat V, Gottesfeld J, Izpisua Belmonte JCI, Murry C, Keirstead HS, Park HS, Schmidt U, Laslett AL, Muller FJ, Nievergelt CM, Shamir R, Loring JF. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human escs and ipscs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell, 2011, 8(1): 106-118.

[13] Bar-Nur O, Russ HA, Efrat S, Benvenisty N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell, 2011, 9(1): 17-23.

[14] Urbach A, Bar-Nur O, Daley GQ, Benvenisty N. Differential modeling of fragile x syndrome by human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2010, 6(5): 407-411.

[15] Bao L, He LXZ, Chen JJ, Wu Z, Liao J, Rao LJ, Ren JT, Li H, Zhu H, Qian L, Gu YJ, Dai HM, Xu X, Zhou JQ, Wang W, Cui C, Xiao L. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res, 2011, 21(4): 600-608.

[16] Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, Loh YH, Li H, Lau F, Ebina W, Mandal PK, Smith ZD, Meissner A, Daley GQ, Brack AS, Collins JJ, Cowan C, Schlaeger TM, Rossi DJ. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mrna. Cell Stem Cell, 2010, 7(5): 618-630.

[17] Hou P, Li Y, Zhang X, Liu C, Guan J, Li H, Zhao T, Ye J, Yang W, Liu K, Ge J, Xu J, Zhang Q, Zhao Y, Deng H. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science, 2013, 341(6146): 651-654.

[18] Esteban MA, Pei DQ. Vitamin c improves the quality of somatic cell reprogramming. Nat Genet, 2012, 44(4): 366-367.

[19] Fluri DA, Tonge PD, Song H, Baptista RP, Shakiba N, Shukla S, Clarke G, Nagy A, Zandstra PW. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nat Methods, 2012, 9(5): 509-516.

[20] Nakagawa M, Taniguchi Y, Senda S, Takizawa N, Ichisaka T, Asano K, Morizane A, Doi D, Takahashi J, Nishizawa M, Yoshida Y, Toyoda T, Osafune K, Sekiguchi K, Yamanaka S. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep, 2014, 4: 3594.

[21] Taapken SM, Nisler BS, Newton MA, Sampsell-Barron TL, Leonhard KA, McIntire EM, Montgomery KD. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotech, 2011, 29(4): 313-314.

[22] Ronen D, Benvenisty N. Genomic stability in reprogramming. Curr Opin Genet Dev, 2012, 22(5): 444-449.

[23] Ben-David U, Benvenisty N. High prevalence of evolutionarily conserved and species-specific genomic aberrations in mouse pluripotent stem cells. Stem Cells, 2012, 30(4): 612-622.

[24] Martins-Taylor K, Nisler BS, Taapken SM, Compton T, Crandall L, Montgomery KD, Lalande M, Xu RH. Recurrent copy number variations in human induced pluripotent stem cells. Nat Biotech, 2011, 29(6): 488-491.

[25] Mayshar Y, Ben-David U, Lavon N, Biancotti JC, Yakir B, Clark AT, Plath K, Lowry WE, Benvenisty N. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2010, 7(4): 521-531.

[26] Hussein SM, Batada NN, Vuoristo S, Ching RW, Autio R, Närvä E, Ng S, Sourour M, Hämäläinen R, Olsson C,Lundin K, Mikkola M, Trokovic R, Peitz M, Brüstle O, Bazett-Jones DP, Alitalo K, Lahesmaa R, Nagy A, Otonkoski T. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature, 2011, 471(7336): 58-62.

[27] Abyzov A, Mariani J, Palejev D, Zhang Y, Haney MS, Tomasini L, Ferrandino AF, Rosenberg Belmaker LA, Szekely A, Wilson M, Kocabas A, Calixto NE, Grigorenko EL, Huttner A, Chawarska K, Weissman S, Urban AE, Gerstein M, Vaccarino FM. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature, 2012, 492(7429): 438-442.

[28] Hamada M, Malureanu LA, Wijshake T, Zhou W, van Deursen JM. Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability. PLoS Genet, 2012, 8(8): e1002913.

[29] Ji JF, Ng SH, Sharma V, Neculai D, Hussein S, Sam M, Trinh Q, Church GM, Mcpherson JD, Nagy A, Batada NN. Elevated coding mutation rate during the reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem cells. Stem Cells, 2012, 30(3): 435-440.

[30] Cheng LZ, Hansen NF, Zhao L, Du YT, Zou CL, Donovan FX, Chou BK, Zhou GY, Li SJ, Dowey SN, Ye ZH, Chandrasekharappa SC, Yang HM, Mullikin JC, Liu PP. Low incidence of DNA sequence variation in human induced pluripotent stem cells generated by nonintegrating plasmid expression. Cell Stem Cell, 2012, 10(3): 337-344.

[31] Polo JM, Liu S, Figueroa ME, Kulalert W, Eminli S, Tan KY, Apostolou E, Stadtfeld M, Li Y, Shioda T, Natesan S, Wagers AJ, Melnick A, Evans T, Hochedlinger K. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol, 2010, 28(8): 848-855.

[32] Young MA, Larson DE, Sun CW, George DR, Ding L, Miller CA, Lin L, Pawlik KM, Chen K, Fan X, Schmidt H, Kalicki-Veizer J, Cook LL, Swift GW, Demeter RT, Wendl MC, Sands MS, Mardis ER, Wilson RK, Townes TM, Ley TJ. Background mutations in parental cells account for most of the genetic heterogeneity of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2012, 10(5): 570-582.

[33] McConnell MJ, Lindberg MR, Brennand KJ, Piper JC, Voet T, Cowing-Zitron C, Shumilina S, Lasken RS, Vermeesch JR, Hall IM, Gage FH. Mosaic copy number variation in human neurons. Science, 2013, 342(6158): 632-637.

[34] Liu P, Kaplan A, Yuan B, Hanna JH, Lupski JR, Reiner O. Passage number is a major contributor to genomic structural variations in mouse ips cells. Stem Cells, 2014, doi: 10.1002/stem.1779.

[35] Suzuki K, Yu C, Qu J, Li M, Yao XT, Yuan TT, Goebl A, Tang SW, Ren RT, Aizawa E, Zhang F, Xu XL, Soligalla RD, Chen F, Kim J, Kim NY, Liao HK, Benner C, Esteban CR, Jin YB, Liu GH, Li YR, Izpisua Belmonte JC. Targeted gene correction minimally impacts whole-genome mutational load in human-disease-specific induced pluripotent stem cell clones. Cell Stem Cell, 2014, 15(1): 31-36.

[36] Vaziri H, Chapman K, Guigova A, Teichroeb J, Lacher MD, Sternberg H, Singec I, Briggs L, Wheeler J, Sampathkumar J, Gonzalez R, Larocca D, Murai J, Snyder E, Andrews W, Funk WH, West MD. Spontaneous reversal of the developmental aging of normal human cells following transcriptional reprogramming. Regen Med, 2010, 5(3): 345-363.

[37] Wang F, Yin Y, Ye XY, Liu K, Zhu HY, Wang LL, Chiourea M, Okuka M, Ji GZ, Dan JM, Zuo BF, Li MS, Zhang Q, Liu N, Chen LY, Pan XH, Gagos S, Keefe DL, Liu L. Molecular insights into the heterogeneity of telomere reprogramming in induced pluripotent stem cells. Cell Res, 2012, 22(4): 757-768.

[38] Yehezkel S, Rebibo-Sabbah A, Segev Y, Tzukerman M, Shaked R, Huber I, Gepstein L, Skorecki K, Selig S. Reprogramming of telomeric regions during the generation of human induced pluripotent stem cells and subsequent differentiation into fibroblast-like derivatives. Epigenetics, 2011, 6(1): 63-75.

[39] Prigione A, Lichtner B, Kuhl H, Struys EA, Wamelink M, Lehrach H, Ralser M, Timmermann B, Adjaye J. Human induced pluripotent stem cells harbor homoplasmic and heteroplasmic mitochondrial DNA mutations while maintaining human embryonic stem cell-like metabolic reprogramming. Stem Cells, 2011, 29(9): 1338-1348.

[40] Sharma A, Diecke S, Zhang WY, Lan F, He C, Mordwinkin NM, Chua KF, Wu JC. The role of sirt6 protein in aging and reprogramming of human induced pluripotent stem cells. J Biol Chem, 2013, 288(25): 18439-18447.

[41] Banito A, Rashid ST, Acosta JC, Li S, Pereira CF, Geti I, Pinho S, Silva JC, Azuara V, Walsh M, Vallier L, Gil J. Senescence impairs successful reprogramming to pluripotent stem cells. Genes Dev, 2009, 23(18): 2134-2139.

[42] Tanabe K, Nakamura M, Narita M, Takahashi K, Yamanaka S. Maturation, not initiation, is the major roadblock during reprogramming toward pluripotency from human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(30): 12172-12179.

[43] Ohta S, Nishida E, Yamanaka S, Yamamoto T. Globalsplicing pattern reversion during somatic cell reprogramming. Cell Rep, 2013, 5(2): 357-366.

[44] Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature, 2007, 448(7151): 313-317.

[45] Mikkelsen TS, Hanna J, Zhang XL, Ku MC, Wernig M, Schorderet P, Bernstein BE, Jaenisch R, Lander ES, Meissner A. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature, 2008, 454(7205): 794-794.

[46] Fussner E, Djuric U, Strauss M, Hotta A, Perez-Iratxeta C, Lanner F, Dilworth FJ, Ellis J, Bazett-Jones DP. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. Embo J, 2011, 30(9): 1778-1789.

[47] Mansour AA, Gafni O, Weinberger L, Zviran A, Ayyash M, Rais Y, Krupalnik V, Zerbib M, Amann-Zalcenstein D, Maza I, Geula S, Viukov S, Holtzman L, Pribluda A, Canaani E, Horn-Saban S, Amit I, Novershtern N, Hanna JH. The h3k27 demethylase utx regulates somatic and germ cell epigenetic reprogramming. Nature, 2012, 488(7411): 409-413.

[48] Ang YS, Tsai SY, Lee DF, Monk J, Su J, Ratnakumar K, Ding JJ, Ge YC, Darr H, Chang B, Wang JL, Rendl M, Bernstein E, Schaniel C, Lemischka IR. Wdr5 mediates self-renewal and reprogramming via the embryonic stem cell core transcriptional network. Cell, 2011, 145(2): 183-197.

[49] Yang P, Wang YX, Chen JY, Li H, Kang L, Zhang Y, Chen S, Zhu B, Gao SR. Rcor2 is a subunit of the lsd1 complex that regulates esc property and substitutes for sox2 in reprogramming somatic cells to pluripotency. Stem Cells, 2011, 29(5): 791-801.

[50] Li X, Shan ZY, Wu YS, Shen XH, Liu CJ, Shen JL, Liu ZH, Lei L. Generation of neural progenitors from induced bama miniature pig pluripotent cells. Reproduction, 2014, 147(1): 65-72.

[51] Ohi Y, Qin H, Hong C, Blouin L, Polo JM, Guo T, Qi Z, Downey SL, Manos PD, Rossi DJ, Yu J, Hebrok M, Hochedlinger K, Costello JF, Song JS, Ramalho-Santos M. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human ips cells. Nat Cell Biol, 2011, 13(5): 541-549.

[52] Williams K, Christensen J, Pedersen MT, Johansen JV, Cloos PAC, Rappsilber J, Helin K. Tet1 and hydroxymethylcytosine in transcription and DNA methylation fidelity. Nature, 2011, 473(7347): 343-348

[53] Koch CM, Reck K, Shao KF, Lin Q, Joussen S, Ziegler P, Walenda G, Drescher W, Opalka B, May T, Brummendorf T, Zenke M, Saric T, Wagner W. Pluripotent stem cells escape from senescence-associated DNA methylation changes. Genome Res, 2013, 23(2): 248-259.

[54] Deng J, Shoemaker R, Xie B, Gore A, LeProust EM, Antosiewicz-Bourget J, Egli D, Maherali N, Park IH, Yu J, Daley GQ, Eggan K, Hochedlinger K, Thomson J, Wang W, Gao Y, Zhang K. Targeted bisulfite sequencing reveals changes in DNA methylation associated with nuclear reprogramming. Nat Biotech, 2009, 27(4): 353-360

[55] Saitou M, Kagiwada S, Kurimoto K. Epigenetic reprogramming in mouse pre-implantation development and primordial germ cells. Development, 2012, 139(1): 15-31.

[56] Zhang H, Jiao WW, Sun L, Fan JY, Chen MF, Wang H, Xu XY, Shen AD, Li T, Niu BB, Ge SF, Li W, Cui JW, Wang GJ, Sun JN, Fan XQ, Hu X,, Mrsny Randall J, Hoffman Andrew R, Hu J-F. Intrachromosomal looping is required for activation of endogenous pluripotency genes during reprogramming. Cell Stem Cell, 2013, 13(1): 30-35.

[57] Tchieu J, Kuoy E, Chin MH, Trinh H, Patterson M, Sherman SP, Aimiuwu O, Lindgren A, Hakimian S, Zack JA, Clark AT, Pyle AD, Lowry WE, Plath K. Female human ipscs retain an inactive x chromosome. Cell Stem Cell, 2010, 7(3): 329-342.

[58] Maherali N, Sridharan R, Xie W, Utikal J, Eminli S, Arnold K, Stadtfeld M, Yachechko R, Tchieu J, Jaenisch R, Plath K, Hochedlinger K. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell, 2007, 1(1): 55-70.

(责任编委: 高绍荣)

Reprogramming mechanism and genetic stability of induced pluripotent stem cells (iPSCs)

Caifang Ren, Hongyan Sun, Lizhong Wang, Guomin Zhang, Yixuan Fan, Guangyao Yan, Dan Wang, Feng Wang

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) were reprogrammed from somatic cells using specific transcription factors. Bypassing the ethical issue caused by embryonic stem cells (ESCs), iPSCs can be successfully induced from a variety of cells, which makes iPSCs a powerful research tool for developmental biology. iPSCs have also become indispensable to the research of life science due to their broad potential applications. However, it's a big challenge to obtain iPSCs with high quality and genetic stability. Here, we review the research progress of increasing the reprogramming mechanism and genetic stability of iPSCs in order to provide references of reprogramming efficiency of iPSCs, reducing the cost, and addressing key points of iPSCs quality control, further promotingclinical application of the iPSCs.

iPSCs; genetic stability; reprogramming; epigenetics

Jiangsu Livestock Embryo Engineering Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

2014-04-17;

2014-07-12

国家自然科学基金项目(编号：31272443)资助

任才芳，博士研究生，研究方向：胚胎干细胞。E-mail: 2012105033@njau.edu.cn

王锋，博士，教授，研究方向：动物胚胎工程。E-mail: caeet@njau.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0879

时间: 2014-8-12 14:18:59

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140812.1418.003.html