高效液相色谱法测定雪胆素片中雪胆素甲的含量

2014-05-25苏健

云南中医学院学报 2014年2期

苏健

（昆明市食品药品检验所，云南昆明 650032）

“雪胆素片”是云南省在上世纪80年代初从彝族药物“罗锅底”开发的成药制剂，收载于《卫生部药品标准》[1]，具有清热解毒，抗菌消炎之功效，用于菌痢、肠炎、支气管炎、急性扁桃体炎等[2]。其药效物质是从罗锅底Hemsleya maerosperma C.Y.Wu等葫芦科雪胆属植物中提取的“雪胆素”，主要含有三萜类成分雪胆素甲（Cucurbitacin IIa）和雪胆素乙（Cucurbitacin IIb）[3]。

在“雪胆素片”及其原料药“雪胆素”现行标准中，其质量控制项的定量测定部分采用的是分光光度法测定雪胆素甲的含量。随着药品安全要求的提高和药品质量控制技术的发展，该方法已经不能适应目前行业发展需求。经过较为系统的研究，我们建立了一种测定雪胆素片中雪胆素甲含量的高效液相色谱方法，可用于雪胆素及其制剂的质量控制。

1 仪器与材料

Agilent 1100型高液相色谱仪（美国安捷伦公司），HPLC 1100 ChemStation工作站；AEG-45SM 型百万分之一分析天平（日本岛津公司）；上海Branson B3200S超声清洗器；依利特色谱柱（Kromasil C18填料，4.6×150mm，5μm）。对照品雪胆素甲由中国食品药品检定研究院提供（编号111518）。流动相用乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。雪胆素片药品为昆明宇斯药业有限责任公司产品。

2 方法与结果

2.1 测定条件

2.1.1 色谱条件

经过优选的色谱条件如下：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温25℃；流动相用乙腈-水的混合溶液（40∶60），流速1mL/min，检测波长212nm，进样量10μL。理论板数以雪胆素甲峰计算不低于6000。在此条件下（图1），雪胆素甲对照品峰的拖尾因子为0.99，雪胆素片样品中雪胆素甲和邻近峰分离大于2.0，阴性对照样品无干扰，符合药品分析的一般技术要求。

图1 雪胆素甲（a）、雪胆素片（b）、阴性对照样品（c）的高效液相色谱

2.1.2 检测波长确定

取雪胆素甲对照品以甲醇溶解，以甲醇作空白对照在200～400nm波长范围扫描紫外吸收，结果在212nm波长处有最大吸收，故选择212nm为检测波长，结果见图2。

图2 雪胆素甲紫外吸收曲线

2.2 对照品溶液制备

精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的雪胆素甲对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的溶液，临用时用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 供试品溶液制备

取雪胆素片，研细，取约0.7g，精密称定，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理10min，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，临用时用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 线性关系的考察

按上述方法制备雪胆素甲对照品溶液，浓度为0.242mg/mL，分别精密量取对照品溶液 1μL，2μL，5μL，10μL，15μL，20μL，25μL，按上述色谱条件进样测定，以进样量（μg）为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行线性回归处理，回归方程为Y=246.53X+9.0096，r=0.9999（n=7）。结果表明，雪胆素甲在进样量0.242～6.05μg之间与峰面积呈良好线性关系，结果见表1。

表1 线性关系考察

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液10μL，按上述色谱条件，连续进样6次，测得峰面积积分值的平均值为605.26，RSD 为 0.36%（n=6），结果见表 2。

表2 精密度实验

2.6 稳定性试验

取同一批号雪胆素片（20120902），依法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定7次，每次间隔4h，测得峰面积积分值平均值为592.63，RSD为1.52%（n=7）。结果表明，样品在24h内稳定，结果见表3。

表3 稳定性实验

2.7 重现性试验

取同一批号雪胆素片（20120902），平行取6份样依法制成供试品溶液，按上述色谱条件外标法测定雪胆素甲的含量，以标示量计雪胆素甲的平均含量为104.37%，RSD为0.26%（n=6）。结果表明，该法重现性良好，结果见表4。

表4 重现性实验

2.8 加样回收率试验

取已知含量的雪胆素片（批号：20120902，8.26mg/g）研细，取9份，每份0.35g，精密称定，再分别加入雪胆素甲对照品适量，按供试品溶液的制备和样品测定项下操作，平均回收率为96.80%，RSD为 0.44%（n=9），结果见表 5。

2.9 样品测定

取雪胆素片样品共10批，按照上述确定的方法测定，结果见表6。

3 讨论

葫芦科雪胆属植物中富含三萜类成分，其中以雪胆素类成分为主[4]。雪胆素具有较高的药理活性，有广谱抗菌效果，并且对心血管系统也有作用，雪胆属植物分布比较广泛，其中又以云南和浙江资源较丰富[5]，以雪胆属植物开发的制剂品种繁多[6]，因此有效控制好这类制剂的质量有重要的意义。

表5 加样回收率试验结果

现行雪胆素片质量标准中采用可见紫外分光光度法测定雪胆素甲的含量，此方法用比色法定量，利用化学显色的模式测定吸光度，以发色官能团的表征来测定总量，但测定结果包含具有相同官能团结构的三萜同系物，转专属性差，同时受实验操作、环境条件等因素影响较大。而高效液相色谱方法是在色谱分离的基础上，对于特定位置的吸收峰进行定量，更具有专属性，测定结果更客观，并且实验操作更简化，受环境等条件影响更小。

现研究采用高效液相色谱外标法测定雪胆素甲的含量，在专属性、准确度、灵敏度、重现性、稳定性等方面均能达到药品分析的技术要求，可作为雪胆素及其制剂的定量检测方法，更好地控制其质量。