不同时期条纹环沟藻可培养藻际细菌研究

王 剑,王朝晖,熊毅俊 (暨南大学生态学系,水体富营养化与赤潮防治广东普通高校重点实验室,广东 广州510632)

在微藻周围聚集了以细菌为主的大量微生物,微生物与藻细胞及其胞外分泌物所形成的特殊环境被称为“藻际环境”,藻际环境中的细菌称为藻际细菌,是一个具有特殊结构和功能的群体

[1].在藻类生长的不同时期以及浮游植物群落变动过程中,藻际细菌密度和群落结构均会发生变化[2].而且不同藻类的藻际细菌也具有种间特异性[3-4],如亚历山大藻属(Alexandrium)中的不同种类藻际细菌组成有所不同[5-6].目前已经证实一些赤潮藻类的藻际细菌具有杀藻作用[7],而且在赤潮藻消亡过程中,溶藻细菌密度增加[3,8-9].因此,藻际细菌可能在赤潮生消过程中起着重要的调控作用[10].

条纹环沟藻(Gyrodinium instriatum)是珠江口常见的赤潮生物,曾多次在珠江口引发赤潮[11-13];在国外,仅在日本和厄瓜多尔报道了条纹环沟藻赤潮的发生[14-15].本研究对条纹环沟藻不同生长时期的藻际细菌进行了分离培养,通过16S rDNA V3区序列测定与对比对细菌进行了分子分类鉴定,同时分析了藻细胞不同时期细菌的群落结构和丰度变化,以揭示条纹环沟藻不同生长时期藻际细菌群落结构的变化,为进一步了解藻际细菌在条纹环沟藻赤潮生消过程中的作用提供参考.

1 材料与方法

1.1 藻种来源与其培养

实验藻种为条纹环沟藻,为2009年珠江口赤潮期间分离培养得到的单细胞培养株.藻种驯化培养和扩大培养采用 f/2培养基.培养基所用的人工海水由 Instant Ocean牌海盐配制,盐度为32,pH 值为 7.9±0.1.配制的人工海水经孔径为0.25μm的混合纤维滤膜过滤灭菌后,添加营养元素备用.培养温度为 20℃,光照强度为 100μmol/(m2˙s),光暗比为 L:D = 12h:12h.

1.2 藻细胞生长曲线的测定

将处于对数生长期的藻细胞转接至 250mL三角瓶中,初始接种密度为 390cells/mL,藻细胞培养条件同 1.1,实验设置 3个平行.培养时间为38d,每隔2d取1.5mL的培养液测定叶绿素荧光值,根据叶绿素荧光与细胞密度的关系(y=3.3594x+48.308,R2=0.9998,其中y为叶绿素荧光值,x为藻细胞数量)计算细胞数量.

1.3 藻际细菌的分离培养

在环沟藻生长周期中选取 5个时期,在无菌条件下,吸取 1mL藻细胞培养液,用梯度稀释法进行稀释,稀释的倍数为 10-1～10-6,吸取 10-3～10-6的4个梯度稀释液100μL均匀涂布于2216E固体培养基培养皿中,培养皿置于28℃恒温培养箱培养.培养5～7d后对不同形态的单菌落进行分离纯化培养2～3次.

1.4 单菌落16S rDNA V3区的PCR扩增与分子鉴定

用灭菌的牙签挑取单菌落于含 100μL去离子水的离心管中,沸水浴 7min,-20℃ 7min,反复融冻循环3次后,10000r/min离心10min,吸取上清液 4μL作为 PCR模板.采用原核生通用引物341F (5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和907R (5′-CCGTCAAATCMTTGAGTTT-3′)对细菌rRNA基因16S V3区的保守序列进行PCR扩增.扩增体系为 30μL,扩增体系中各组分含量为别为:10×buffer 3μL,dNTP 1μL,上下游引物各0.3μL,rTaq DNA 聚合酶 0.4μL,DNA 液 4μL,ddH2O 21μL.PCR 扩增反应程序为:95℃ 4min,35×(95℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 40s),72℃ 7min,4℃+∞.扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行检测.

PCR扩增产物由深圳华大基因科技有限公司测序,测序长度在550bp左右.测序获得的序列在 NCBI上通过BLAST比对,在 GenBank上下载同源性最高的 16S rRNA序列.菌株间的相似度大于等于97%表示相同的种,在93%～97%间表示相同的属,小于93%表示不同的属[16].

1.5 系统发育树的构建

在GenBank上下载同源性最高的16S rDNA V3区序列,用 Clustalx2.0软件包进行比对,用MEGA 5.0进行系统发育分析,计算遗传距离,遗传距离小于0.046属于种内差异;0.046～0.06为种间属内差异[17-18].根据Kimura 2参数法计算进化距离,构建N-J系统树,自举值(bootstrap)为1000.

1.6 可培养细菌菌落结构分析

选择合适菌落个数(30～300)的培养皿,计数不同细菌的菌落数,根据培养皿接种的稀释倍数即可得到1mL藻液中细菌总数.

将细菌数量取自然对数后,用 spss19.0软件采用多维尺度分析法和组间联接的聚类分析法对藻细胞不同生长时期的群落结构进行分析.

2 结果与分析

2.1 条纹环沟藻的生长曲线

图1为条纹环沟藻的生长曲线,在经历了3d的延滞期后,藻细胞进入了对数生长期,对数增长一直维持到第 18d,随后是短暂的稳定生长期,很快细胞密度迅速下降.分离培养藻际细菌的 5个时期,时期Ⅰ为延滞期,时期Ⅱ为对数生长中期,时期Ⅲ为稳定生长期,时期Ⅳ衰亡前期,时期Ⅴ为衰亡后期.

图1 条纹环沟藻的生长曲线Fig.1 The growth curve of Gyrodinium instriatum标注了细菌培养取样的5个时期

2.2 条纹环沟藻藻际细菌的分子鉴定

在条纹环沟藻的 5个不同时期总共分离出32株细菌,经过16s rDNA V3区序列测定,去除重复序列,共得到菌株 12株不同的菌株,编号为Gi-1～Gi-12,GenBank序列登录号为 KF444158-KF444169.条纹环沟藻中分离的可培养细菌分为α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)4大类(表 1),12株细菌中6株属于α-变形菌纲,3株γ-变形菌纲,2株属于拟杆菌门,1株属于放线菌门.

根据不同菌株与GenBank上已知序列的相似度(表 1),可以得出 Gi-2、Gi-3以及 Gi-5～Gi-8这6株细菌属于α-变形菌纲.其中Gi-2没有与之相似的同种或同属的细菌,仅与红螺菌属的一个序列(Rhodospirillumsp.,NC007643)相似度为90%,已经超出了属间差异[16],因此为α-变形菌纲某个种;Gi-3与Erythrobacter litoralis(NC007722)相似度为 99%,可认为是Erythrobacter litoralis;Gi-5与反硝化玫瑰杆菌(Roseobacter denitrificans,NC008209)相似度为98%,可认为是反硝化玫瑰杆菌;Gi-6与一株鲁杰氏菌属(Ruegeriasp.,NC008044)相似度为 99%,可认为属于鲁杰氏菌属;Gi-7与Polymorphum gilvum(NC015259)相似度为 99%,可认为是Polymorphum gilvum;Gi-8与Phaeobacter gallaeciensis(NC018286)相似度为 97%,可认为是Phaeobacter gallaeciensis.

属于γ-变形菌纲的3株菌株分别是Gi-1、Gi-4、Gi-12,其中 Gi-1与麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii,NC011138)序列相似度为99%,可认为是麦氏交替单胞菌;Gi-4与Marinobacter adhaerens(NC017506)相似度为97%,可认为是Marinobacter adhaerens;Gi-12与鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii,(NC017847)相似度为 97%,可认为是鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii).

Gi-9和 Gi-10属于拟杆菌门,Gi-9与Robiginitalea biformata(NC013222)相似度为92%,Gi-10与Gramella forsetii(NC008571)相似度为 91%,低于属内差异(93%),因此也只能判断两者为拟杆菌门的某个属.

只有 Gi-11属于放线菌门,与金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens,NC008711)相似度为98%,可认为是金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens).

表1 条纹环沟藻藻际细菌与GenBank上相似菌株16S rDNA V3区序列的相似度比较Table 1 The identities between bacteria isolated from G. instriatum and the closest related sequences from GenBank based on V3 region of 16s rDNA

12株细菌的测序序列与GenBank上13个相似序列的遗传距离(表2)所反映的结果与相似性一致,各菌株与相似性最高的菌株遗传距离最近.其中Gi-2、Gi-9和Gi-10与它们最近菌株的遗传距离超出了属内差异范畴,而其余菌株与其相近序列间的遗传距离均小于0.046,属于种内差异范畴.

2.3 藻际细菌系统发育分析

图2所示为条纹环沟藻分离得到的12株菌株与GenBank上14个相似度最高的菌株序列之间构建的邻接系统树(N-J树).与表 1的结果相同,26个序列分为α-变形菌纲、γ-变形菌纲、拟杆菌门和放线菌门4个大分支.本研究中的6株α-变形菌与GenBank上6个相似序列以99%的支持率聚为一支,其中 Gi-5、Gi-6和Gi-8与 3个相似序列以 100%的支持率聚为红杆菌科(Rhodobacteraceae)分支,Gi-7与 1个序列以100%的支持率聚为Polymorphum分支,Gi-2与1个序列以 99%的支持率聚为红螺菌属(Rhodospirillum)分支,Gi-3与1个序列以100%的支持率与赤杆菌属(Erythrobacter)聚成一支.

表2 条纹环沟藻的12株藻际细菌与GenBank上最相似序列之间的遗传距离Table 2 Genetic distances among 12strains of bacteria isolated from G. instriatum and the closest sequences from GenBank, the shortest distance is marked in bold font

图2 条纹环沟藻藻际细菌16S rDNA V3序列与GenBank上14个相近序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of 16S rDNA V3region of bacteria strains from G. instriatum and fourteen sequences obtained from GenBank. Scale bar=2% difference in nucleotide sequences

3株γ-变形菌与GenBank上5个相似序列以97%的支持率聚为一支,其中Gi-1与1个序列以100%的支持率聚为交替单胞菌属(Alteromonas),Gi-4与1个序列以100%的支持率聚为海杆菌属(Marinobacter)分支,Gi-12与1个序列以100%的支持率聚为不动杆菌属(Acinetobacter)分支.本研究中唯一 1株放线菌 Gi-11与 GenBank上的Arthrobacter aurescens以100%的支持率聚为节杆菌属(Arthrobacter)一支.2株拟杆菌与GenBank上2个相似序列聚为一支,其中 Gi-9与1个序列聚为Robiginitalea分支,Gi-10与1个序列聚为革兰菌属(Gramella)分支.

2.4 藻际细菌菌落结构

由图 3可见,不同生长时期的条纹环沟藻可培养细菌的种类数为 5～8种之间,其中稳定生长期细菌种类数较为丰富,而在延滞期和衰亡后期细菌种类较少.从各个生长时期的细菌总数来看,延滞期(时期I)细菌数量较低,对数生长期(时期II)细菌数量达到最低,仅为 2.83×106CFU/mL;随后细菌数量增加,在衰亡前期(时期 IV)细菌数量最高,达到 1.72×109CFU/mL,是其余生长时期细菌数量的 1～2个数量级;衰亡后期虽然细菌数量有所降低,但仍达到1.37×108CFU/mL.

图3 条纹环沟藻不同生长时期藻际细菌种类数与细菌总数Fig.3 Species number and abundance of bacteria in phycosphere of G. instriatum

图4 不同生长时期的条纹环沟藻12株藻际细菌数量Fig.4 The abundance of 12 strains of bacteria in different growth stages of G. instriatum

从图 4可以发现,某些菌株只是特异性出现在某个生长时期或者某一阶段,如Gi-4、Gi-6只在延滞期出现,Gi-8只在对数中期出现,Gi-11只在稳定期出现,Gi-12只在衰亡前期出现.Gi-12是衰亡前期的绝对优势菌群,占细菌总数的96.5%,同时也导致了该时期细菌数量的急剧增加.Gi-12为γ-变形菌纲的鲍氏不动杆菌,该菌的大量出现可能与藻类迅速进人衰亡阶段有关.Gi-1和 Gi-3是环沟藻最常见藻际细菌,在每个时期都出现,而且是各生长时期的优势菌之一,说明它们的存在对藻类生长周期没有明显影响.

2.5 条纹环沟藻5个不同生长时期的细菌群落结构的多维尺度和聚类分析

图5 条纹环沟藻不同时期细菌群落组成聚类分析(A)和多维尺度分析(B)Fig.5 Cluster analysis (A) and multidimensional scaling analysis (B) of bacterial community composition in different growth stages of G. instriatum

图5中,5个生长时期可分为两类,时期I、II、III、V聚为一大类,时期Ⅳ单独成一类.而多维度分析结果同样显示,时期II和时期III聚在一起,衰亡前期(时期 IV)与其他生长时期相距均较远.说明衰亡前期,条纹环沟藻藻际细菌的数量和组成与其他时期差异较大,此结果与不同生长时期藻际细菌菌落结构结果相近(图3,图4),衰亡前期的细菌数量明显高于其他生长时期,细菌数量是其余生长时期的13.2～639倍,而在该时期出现了大量的特异性细菌鲍氏不动杆菌(Gi-12).其余 4个生长时期可分为3类,其中对数生长期(II)和稳定生长期(III)位置较接近,为一类.说明藻细胞快速生长阶段菌落结构相近,而衰亡后期(V)和迟滞期(I)菌落组成也有所差异.

3 讨论

条纹环沟藻藻际可培养细菌的组成与海洋环境中的常见细菌组成相近,藻际细菌的优势菌群α-变形菌纲和γ-变形菌纲均为海洋环境中常见细菌类群[19-21].条纹环沟藻藻际细菌组成与其他海洋藻类的藻际细菌组成也具有一定的相似性,如塔玛亚历山大藻藻际细菌主要以α-变形菌纲的玫瑰菌属细菌为主,还包括一些拟杆菌门菌株[5];丰迪亚历山大藻(Alexandrium fundyense)的藻际细菌主要以γ-变形菌纲为主,包括有交替单胞菌科、假交替单胞菌科、红杆菌科以及拟杆菌门的黄杆菌科[6];而裸甲藻藻际环境中的可培养细菌以变形菌门细菌(70%)为主,其次为拟杆菌门细菌(26%),还有少量属于放线菌门[22];Sapp等

[23]在北海赫尔戈兰岛调查中发现一些优势硅藻和甲藻的藻际细菌多属于α-变形菌纲、γ-变形菌纲及拟杆菌门中的黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲.上述研究报道以及本研究结果都说明海洋浮游植物的藻际细菌多是以变形菌门和拟杆菌门的细菌类群为主.

条纹环沟藻在不同生长时期藻际环境中的细菌数量和群落结构组成呈现不同的特点.在生长旺盛期,细菌数量少,但种类较多;随着衰亡期的到来,细菌种类减少,但数量大大增加(图 3,图4).在藻细胞生长过程中,细菌群落的这种变化与藻类在不同时期的生理状态有关,同时细菌和藻类也产生相互作用与相互影响[2,24].在赤潮藻消亡过程中,具有溶藻特性的细菌的密度会迅速增加,这可能和藻迅速进入衰亡期有关[8-9].在本研究中,衰亡前期(时期IV)的特异性菌株 Gi-12大量出现,可能与环沟藻细胞迅速进入衰亡期有关.Gi-12为鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii),不动杆菌属的细菌对多种蓝藻以及绿藻具有溶藻作用[25-26],然而对海洋微藻的研究作用报道较少.有关该菌与条纹环沟藻生长及赤潮消亡的关系还有待进一步研究.

菌株Gi-3在每个时期都出现,是各生长时期的优势菌之一,除了衰亡前期外,在其余生长时期均为第一优势菌群,其在对数生长期、稳定生长期和衰亡后期的比例均超过 80%,说明该菌是条纹环沟藻常见共生菌.Gi-3属于α-变形菌纲赤细菌属(Erythrobacter litoralis),目前尚未有该菌或该属菌株与藻细胞关系的研究报道.

Gi-1虽然不是优势菌群,但也在各个时期均出现.Gi-1属于γ-变形菌纲交替单胞菌属(Alteromonas),而交替单胞菌对多环旋沟藻(Cochlodinium polykrikoides)[27]、中肋骨条藻[28-29]以及海洋卡盾藻[30]均具有明显溶藻作用.因此,麦氏交替单胞菌的存在可能有利于条纹环沟藻获得种群竞争优势,进而促进其赤潮的发生.

4 结论

4.1 条纹环沟藻藻际可培养细菌的组成与海洋环境中的常见细菌组成相近,且与其他海洋藻类的藻际细菌组成有也具有一定的相似性,海洋浮游植物的藻际细菌多是以变形菌门和拟杆菌门的细菌类群为主.

4.2 条纹环沟藻在不同生长时期藻际环境中的细菌数量和群落结构组成呈现不同的特点,衰亡前期的特异性菌株 Gi-12大量出现,可能与环沟藻细胞迅速进入衰亡期有关.

4.3 各个时期均出现的菌株 Gi-1属于交替单胞菌属,该菌株可能对条纹环沟藻的种群竞争起作用.

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