黄芪注射液对人II型肺泡上皮细胞系A549钠离子通道表达的影响及其机制＊

王 敏 李 柯 魏 蕾 刘永明

上皮细胞钠离子通道（Epithelial Sodium Channel，ENaC）是非电压门控的阿米洛利敏感性离子通道，广泛存在于多个组织器官，如肺、肾脏和大肠的腔面。ENaC能特异性地允许钠离子由细胞外进入细胞内，从而调节体内的水钠代谢［1，2］，并受多种激素、化学物质的调控［3］。

在肺中，ENaC主要存在于Ⅱ型肺泡上皮（Alveolar Type ⅠⅠ Epithelial，ATⅡ）［4］，是影响肺泡液体清除率（Alveolar Fluid Clearance，AFC）的决定因素之一。已知AFC的失衡能够引起多种疾病，如肺水肿、急性肺损伤和成人呼吸窘迫综合症［5，6］。因此，可通过上调肺内ENaC的数量及功能，增加AFC，清除肺内过多的液体，从而治疗肺水肿及其相关疾病。

黄芪注射液（Astragalus Ⅰnjection，AⅠ）含有黄芪多糖、黄芪甲甙、维生素及微量元素（硒、硅、钴）等多种有效成分，能增强机体免疫功能，同时具有利尿、保肝、降压等作用。近年来研究表明，黄芪可以治疗多种水肿［7，8］；多种原因引起的肺水肿，如急性脊髓损伤后肺水肿、脂多糖诱导的肺水肿和油酸诱导的肺水肿等［9］。其作用可能与其减少炎症因子产生［10］、调节钠离子通道［11］和水通道蛋白［12］相关，但具体机尚未明确。本研究通过采用部分通道蛋白抑制剂探讨AⅠ对ATⅡ细胞A549ENaC蛋白表达的影响及其发生机制，为黄芪治疗肺水肿提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

ATⅡ细胞系A549购自武汉大学典藏中心。

1.2 主要试剂和仪器

AⅠ购自成都地奥九泓制药厂，批号0311049，规格10ml／支，相当于原药材20g；细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit－8，CCK－8，货号CK04），购自日本同仁化学研究所；MEM培养液（货号SH30021.01），购自南宁基诺生物技术有限公司；兔抗鼠α－ENaC（货号sc－21012）、β－ENaC（货号sc－21013）和γ－ENaC（货号sc－21014）、碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗（货号sc－2057）均购自美国Santa cruz生物科技公司，AG490（货号T3434）购自美国sigma公司；PDTC（货号S1808）、SB203580（货号S1863）和Wortmannin（货号S1952）购自上海Beyotime公司。

1.3 实验方法

1.3.1 A549增殖性检测：采用CCK－8法。将 A549细胞以3－5×104个／孔接种于96孔板中培养，待细胞生长至对数生长期（70%融合）时，加入AⅠ（终浓度分别为0、2、4、8、16和32mg／ml），每个 AⅠ浓度设3个复孔，继续培养12h后加入CCK－8试剂，1h后测定各孔吸光度值（OD值）。

1.3.2 ENaC蛋白表达和抑制试验：采用 Western Blot方法。将处于对数生长期的A549细胞以1×106个／孔接种6孔板，培养48h后加入AⅠ（终浓度分别为0、2、4、8、16和32mg／ml）再孵育12h后观察A549的ENaC表达，筛选促进ENaC蛋白表达的最佳AⅠ浓度，然后以最佳AⅠ浓度分别作用A549细胞4、8、12、24h，筛选促进ENaC蛋白表达的最佳作用时间。分别以该浓度和时间为AⅠ处理A549细胞的条件，观察ENaC蛋白信号通路抑制剂AG490（10μM）、PDTC（10μM）、SB203580（10μM）和 Wortmannin（10μM）对 AⅠ上调α、β、γENaC表达水平的影响，即先将培养A549细胞分为自身空白对照组（对照组）、AⅠ组、抑制剂组和AⅠ＋抑制剂组，在相应组中加入上述抑制剂孵育2h后，再加入AⅠ孵育12h，随后采用 Western Blot方法检测ENaC各亚基表达水平。

A549细胞经以上处理后，PBS洗涤3次，用细胞刮子收集细胞，加入100μl细胞裂解液充分裂解，取总蛋白上清液，加上样缓冲液煮沸10min；进行SDS－PAGE电泳分离蛋白并将蛋白转移到硝酸纤维膜上；硝酸纤维膜经5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h，使用兔抗鼠ENaC各亚基一抗（1∶1 000）于4℃孵育12h后，使用碱性磷酸酶标记的山羊抗兔ⅠgG二抗（1∶5 000）于37℃孵育1h，最后将硝酸纤维膜置于显色液中显色，显色20s后每10s观察一次，至条带明显时取出观察与扫描。以上实验均重复3次，以β－actin作为内参，蛋白电泳条带用Ⅰmage J软件分析光密度，以ENaC与β－actin光密度比值表示ENaC的表达水平（相对表达量）。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计分析软件。实验数据以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布及方差齐性；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AⅠ对A549细胞增殖的影响

分别采用0、2、4、8、16和32mg／ml的 AⅠ处理A549细胞后，各组细胞增殖比较无显著差异（F＝1.728，P＝0.211），见图1。

图1 不同浓度AI对A549细胞增殖的影响

2.2 不同浓度AⅠ对A549细胞ENaC各亚基表达水平的影响

由图2可见，与对照组相比，浓度为4、8和32mg／ml组的α－ENaC表达增加（1.14±0.06，t＝4.04，P＝0.02；1.31±0.07，t＝7.97，P＝0.007；1.29±0.15，t＝3.24，P＝0.04），浓度为2和16mg／ml组的α－ENaC表达差异无统计学意义（1.11±0.14，t＝1.31，P＝0.16；1.40±0.36，t＝1.93，P＝0.09）；与对照组相比，浓度为4、8mg／ml组的β－ENaC表达增加（1.35±0.28，t＝4.49，P＝0.02；1.47±0.33，t＝4.37，P＝0.02），浓度为2、16、32mg／ml组的β－ENaC表达差异无统计学意义（1.29±030，t＝1.18，P＝0.18；1.20±0.20，t＝1.24，P＝0.17；1.30±0.51，t＝0.21，P＝0.43）；与对照组相比，浓度为2、8、16和32mg／ml组的γ－ENaC表达增加（1.10±0.03，t＝7.75，P＝0.008；1.20±0.08，t＝4.21，P＝0.03；1.15±0.06，t＝3.27，P＝0.04；1.23±0.13，t＝3.04，P＝0.049），浓度为4mg／ml组的γ－ENaC表达差异无统计学意义（1.13±0.13，t＝1.77，P＝0.11）。因而只有8mg／ml AⅠ可使A549各ENaC亚基的表达水平均升高，故后续实验选用8mg／ml AⅠ。

图2 不同浓度AI对A549细胞ENaC各亚基表达水平的影响

2.3 AⅠ作用不同时间对A549细胞ENaC各亚基表达水平的影响

由图3可见，用浓度为8mg／ml AⅠ作用于A549细胞4h、8h、12h和24h后发现，作用12h的A549细胞中α、β、γ－ENaC表达均明显高于对照组（1.30±0.10，t＝5.92，P＝0.01；1.24±0.12，t＝2.96，P＝0.04；1.23±0.14，t＝2.96，P＝0.04）；此外，作用4h时β－ENaC的表达也明显高于对照组（1.40±0.29，t＝3.25，P＝0.04）。因而后续实验选用12h作为AⅠ处理细胞的时间。

图3 AI作用不同时间对A549细胞ENaC各亚基表达水平的影响

2.4 信号通路抑制剂对AⅠ上调α－ENaC表达的影响

2.4.1 AG490对α－ENaC表达的影响：与对照组相比，AⅠ组、AG490组和 AⅠ＋AG490组的α－ENaC表达均增加（1.30±0.10，t＝6.21，P＝0.004；1.68±0.09，t＝14.28，P＝ 0.0001；1.76±0.07，t＝24.60，P＝0.0001）。与 AⅠ组相比，AⅠ＋AG490组α－ENaC表达也显著增加（t＝10.90，P＝0.000）。AG490组与AⅠ＋AG490组间α－ENaC表达差异无统计学意义（t＝1.51，P＝0.11）。见图4A。

2.4.2 PDTC对α－ENaC表达的影响：与对照组相比，AⅠ组、PDTC组和 AⅠ＋PDTC组α－ENaC表达均增加（1.30±0.10，t＝6.21，P＝0.004；1.09±0.07，t＝2.45，P＝0.046；1.30±0.09，t＝7.02，P＝0.003）。与 AⅠ组相比，PDTC组α－ENaC表达降低（t＝2.74，P＝0.04），AⅠ＋PDTC组α－ENaC表达差异无统计学意义（t＝0.03，P＝0.49）。与PDTC组相比，AⅠ＋PDTC组α－ENaC表达增加（t＝4.93，P＝0.008）。见图4B。

2.4.3 SB203580对α－ENaC表达的影响：与对照组相比，AⅠ组、SB203580组和 AⅠ＋SB203580组α－ENaC表达均增加（1.30±0.10，t＝6.21，P＝ 0.004；1.50±0.07，t＝17.76，P＝0.0001；1.37±0.05，t＝14.70，P ＝0.0003）。 与 AⅠ 组 相 比，SB203580组α－ENaC 表达增加（t＝4.91，P＝0.008），AⅠ＋SB203580组α－ENaC表达差异无统计学意义（t＝1.50，P＝0.11）。与SB203580组相比，AⅠ＋SB203580组α－ENaC表达降低（t＝15.58，P＝0.0002）。见图4C。

2.4.4 Wortmannin对α－ENaC表达的影响：与对照组相比，AⅠ组和 Wortmannin组α－ENaC表达均增加（1.30±0.10，t＝6.21，P＝0.004；1.16±0.06，t＝5.19，P＝0.007），AⅠ＋Wortmannin组α－ENaC表达差异无统计学意义（1.30±0.33，t＝1.81，P＝0.08）。与 AⅠ组相比，Wortmannin组α－ENaC表达降低（t＝3.81，P＝0.016），而 AⅠ＋Wortmannin组α－ENaC表达差异无统计学意义（t＝0.019，P＝0.49）。与 Wortmannin组相比，AⅠ＋Wortmannin组α－ENaC表达差异无统计学意义（t ＝0.98，P＝0.2）。见图4D。

图4 ENaC蛋白抑制剂对AI上调α－ENaC表达的影响

2.5 信号通路抑制剂对AⅠ上调β－ENaC表达的影响

2.5.1 AG490对β－ENaC表达的影响：与对照组相比，AⅠ组和AⅠ＋AG490组β－ENaC表达均增加（1.24±0.13，t＝4.77，P＝ 0.008；1.20±0.07，t＝5.66，P＝0.005），AG490组差异无统计学意义（1.11±0.15，t＝1.53，P＝0.11）。与 AⅠ组相比，AG490组和AⅠ＋AG490组差异无统计学意义（1.11±0.15，t＝2.46，P＝0.05；1.20±0.07，t＝0.97，P＝0.20）。AG490组与AⅠ＋AG490组β－ENaC表达差异亦无统计学意义（t＝1.86，P＝0.08）。见图5A。2.5.2 PDTC对β－ENaC表达的影响：与对照组相比，AⅠ组β－ENaC表达增加（1.24±0.13，t＝4.77，P＝0.008），PDTC组降低（0.79±0.07，t＝7.09，P＝0.003），AⅠ＋PDTC组差异无统计学意义（0.87±0.16，t＝1.72，P＝0.09）。与 AⅠ组相比，PDTC组和AⅠ＋PDTC组β－ENaC表达均降低（t＝5.64，P＝0.005；t＝3.01，P＝0.03）。与PDTC组相比，AⅠ＋PDTC组的β－ENaC表达差异无统计学意义（t＝1.52，P＝0.11）。见图5B。

2.5.3 SB203580对β－ENaC表达的影响：与对照组相比，AⅠ组和AⅠ＋SB203580组β－ENaC表达均增加（1.24±0.13，t＝4.77，P＝0.008；1.26±0.08，t＝6.79，P＝0.003），SB203580组差异无统计学意义（0.89±0.08，t＝2.42，P＝0.05）。与 AⅠ组相比，SB203580组β－ENaC表达表达降低（t＝15.39，P＝0.0002），AⅠ＋SB203580组差异无统计学意义（t＝0.25，P＝0.41）。与SB203580组相比，AⅠ＋SB203580组的β－ENaC表达增加（t＝12.39，P＝0.0005）。见图5C。

2.5.4 Wortmannin对β－ENaC表达的影响：与对照组相比，AⅠ组和AⅠ＋Wortmannin组β－ENaC表达均增加（1.24±0.13，t＝4.77，P＝0.008；1.33±0.23，t＝2.62，P＝0.04），Wortmannin组差异无统计学意义（1.03±0.08，t＝0.71，P＝0.27）。与 AⅠ组相比，Wortmannin组β－ENaC表达降低（t＝18.06，P＝0.0001），AⅠ＋Wortmannin组差异无统计学意义（t＝0.39，P＝0.36）。Wortmannin组与 AⅠ＋Wortmannin组表达差异无统计学意义（t＝0.35，P＝0.37）。见图5D。

图5 ENaC蛋白抑制剂对AI上调β－ENaC表达的影响

2.6 信号通路抑制剂对AⅠ上调γ－ENaC表达的影响

2.6.1 AG490对γ－ENaC表达的影响：与对照组相比，AⅠ组γ－ENaC表达增加（1.23±0.13，t＝3.57，P＝0.02），AG490组、AⅠ＋AG490组表达差异无统计学意义（1.42±0.30，t＝2.89，P＝0.051；1.38±0.22，t＝2.42，P＝0.12）。与AⅠ组相比，AG490组和AⅠ＋AG490组γ－ENaC表达差异亦无统计学意义（t＝1.47，P＝0.22；t＝0.77，P＝0.25）。见图6A。

2.6.2 PDTC对γ－ENaC表达的影响：与对照组相比，AⅠ组γ－ENaC的表达增加（1.23±0.13，t＝3.57，P＝0.02），PDTC组和AⅠ＋PDTC组均降低（0.90±0.07，t＝3.41，P＝0.04；0.83±0.11，t＝3.69，P＝0.037）。与AⅠ组相比，PDTC组和AⅠ＋PDTC组γ－ENaC的表达均降低（t＝3.44，P＝0.02，t＝4.53，P＝0.01）。与PDTC组相比，AⅠ＋PDTC组的γ－ENaC表达差异无统计学意义（t＝1.04，P＝0.19）。见图6B。

2.6.3 SB203580对γ－ENaC表达的影响：与对照组相比，AⅠ组和SB203580组γ－ENaC的表达均增加（1.23±0.13，t＝3.57，P＝ 0.02；1.26±0.10，t＝5.06，P＝0.007），AⅠ＋SB203580组差异无统计学意义（1.21±0.20，t＝1.82，P＝0.10）。与 AⅠ组相比，SB203580组和 AⅠ＋SB203580组γ－ENaC表达差异无统计学意义（t＝0.36，P＝0.37；t＝0.19，P＝0.43）。见图6C。

2.6.4 Wortmannin对γ－ENaC表达的影响：与对照组相比，AⅠ组γ－ENaC表达增加（1.23±0.13，t＝3.57，P＝0.02），Wortmannin组和 AⅠ＋Wortmannin组差异无统计学意义（1.05±0.17，t＝0.55，P＝0.32；1.15±0.09，t＝2.69，P＝0.06）。与AⅠ组相比，Wortmannin组和AⅠ＋Wortmannin组γ－ENaC表达降低（t＝4.76，P＝0.009；t＝2.48，P＝0.04）。与 Wortmannin组相比，AⅠ＋Wortmannin组γ－ENaC表达差异无统计学意义（t＝1.81，P＝0.08）。见图6D。

3 讨 论

图6 ENaC蛋白抑制剂对AI上调对γ－ENaC表达的影响

近年研究显示，ATⅡ细胞膜上的ENaC在维持肺泡正常的液体清除功能中起重要作用。ENaC对钠离子具有高度选择性，可将肺泡腔内的钠离子摄入到细胞内，保持肺泡腔内液体平衡。因此，通过调控 ENaC可以达到治疗肺水肿的目的［12，13］。赵艳等［11］发现脂多糖（LPS）致急性肺损伤小鼠采用AⅠ处理可以显著上调肺内α－ENaC的mRNA表达水平，促进肺水肿液清除，减轻肺损伤。本研究显示AⅠ可以上调A549细胞ENaC各亚基的表达水平。已有研究［14－18］显示，ENaC蛋白表达可受多种信号通路的调控，如Janus蛋白酪氨酸激酶2／信号转导和转录激活子3（JAK2／STAT3）、核因子－κB（NF－κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3－激酶（PⅠ3K）等信号通路即参与了ENaC的调控。本研究通过使用这些信号通路抑制剂，分析AⅠ上调ENaC表达的机制。

本研究使用JAK2特异性抑制剂AG490后，A549细 胞 α－ENaC 蛋 白 表 达 增 加，β－ENaC 和 γ－ENaC表达也有增加的趋势，但未达到统计学差异，这一结果提示，在A549细胞中JAK2信号通路激活状态可以抑制ENaC的表达。Hosseinzadeh等［15］新近发表的研究结果也显示过表达JAK2可以显著抑制ENaC功能，而AG490（40μM）可以显著增加ENaC功能，即JAK2是ENaC的抑制因子之一。但在本研究中并未观察到AⅠ组与AⅠ＋AG490组间ENaC表达的差异，因此尚不能确定AⅠ是否能通过JAK2信号通路上调ENaC表达。

本实验中使用NF－κB抑制剂PDTC后，AⅠ上调β－ENaC和γ－ENaC表达的作用受到抑制。Lebowitz等［16］的研究结果也显示活化 NF－κB的ⅠκB激酶β（ⅠκB kinase－β，ⅠKKβ）可明显增加β－ENaC和γ－ENaC的蛋白表达，但与α－ENaC的关系不明显。提示 AⅠ可能通过 NF－κB上调β－ENaC和γ－ENaC的表达，并影响ENaC的功能。

使用p38MAPK特异性抑制剂SB203580后，α－ENaC表达增加，β－ENaC表达减少，γ－ENaC表达不受影响，提示在A549细胞中，p38MAPK信号通路对ENaC不同亚基的作用不同。但本研究中AⅠ上调ENaC各亚基表达的作用并未受到SB203580的影响，因此不能确定AⅠ是否能通过p38MAPK信号通路上调ENaC的表达。

使用PⅠ3K特异性抑制剂 Wortmannin后，α－ENaC表达增加，β－ENaC和γ－ENaC表达无明显变化；AⅠ＋Wortmannin组γ－ENaC表达低于 AⅠ组，但降低幅度较小，AⅠ是否能通过PⅠ3K信号通路上调ENaC表达还需要进一步实验证实。

综上所述，本研究通过体外实验发现AⅠ具有促进肺内水钠平衡，防治肺水肿、肺损伤等疾病的作用。其机制是AⅠ通过NF－κB信号通路调控ENaC的表达来实现的。