白藜芦醇对K562白血病细胞抑制增殖和诱导分化的作用

赵燕娜，高瑞兰，汪丽佩，余潇苓，尹利明

（1.浙江中医药大学附属第一医院血液病研究所，浙江杭州 310006；2.浙江中医药大学基础医学院病理学教研室，浙江杭州 310053）

白血病是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率在儿童和青年的恶性肿瘤中位居首位，其生物学特征是造血细胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡过程发生障碍、异常分化的细胞大量增殖。目前临床上常用的白血病细胞分化诱导剂有维甲酸及其衍生物、砷剂等，但其治疗范围仅限于急性早幼粒细胞白血病，应用范围局限，且有一定的毒副作用，长期应用仍有争议。由于天然化合物的毒性小，逐渐成为研究白血病分化的热点。白黎芦醇（resveratrol，Res），化学名 3，4’，5-三羟基-反 -均二苯代乙烯（3，4’，5-trihydroxystilbene），分子式C14H12O3，分子质量：228.2，属于非黄酮类多酚化合物［1］。对人体具有调节脂质代谢、抑制血小板聚集、保护心血管、抗炎、抗肿瘤［2-3］等多种生物学活性和药理作用。有研究发现Res能够诱导白血病细胞凋亡和促进分化［4］，但是其机制尚不明确。

GATA-1是造血细胞红系分化和成熟过程中的核心转录因子，主要调节红系和巨核系分化。PU.1是另一个早期髓细胞发育的关键调节蛋白，主要在髓系和B淋巴细胞中表达。二者相互作用构成一个造血调控网络，其活性下降容易诱发骨髓的恶性转化［5］。基于以上理论，本研究以具有多向分化潜能的K562白血病细胞株作为研究对象，观察特异性转录因子GATA-1和PU.1，以及白血病细胞的分化相关抗原阳性细胞表达率，探讨Res抑制K562细胞增殖、诱导分化的作用机制，为筛选抗白血病药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 K562细胞由本实验室保存，Res购自美国Sigma公司，IMDM培养基购自美国 Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，PE标记的小鼠抗人CD11b、CD14、CD42b抗体、购自美国BD公司，GATA-1、PU.1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，β-actin内参抗体购自联科生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将K562细胞常规培养于含10%小牛血清的IMDM完全培养基中，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，2 d换液传代1次，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.2 半固体集落生成实验 计数并调整细胞浓度为5×106·L-1，进行K562白血病细胞集落培养，分别加入白藜芦醇使其终浓度为0、6.25、12.5、25、50、100μmol·L-1。培养体系为：IMDM培养液、30%小牛血清、1%L-谷氨酰胺、100U青／链霉素、0.3%琼脂，接种于24孔板，每孔接种0.5 ml，重复3孔。置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养6 d。以大于40个细胞的聚合为一个K562白血病细胞集落，记录白血病细胞集落数，并计算抑制率／%＝（对照组集落数-实验组集落数）／对照组集落数×100%，每组实验重复3次。

1.2.3 流式细胞术检测分化相关抗原阳性细胞的表达率 收集各组细胞，PBS洗涤并调整细胞浓度为1×1011·L-1，取50μl细胞悬液分别加入分化相关抗原CD11b、CD14、CD42b单克隆抗体，4℃孵育30 min，PBS洗去未结合的抗体，上机检测，每一个检测标本记录10 000个细胞。DIVA软件进行阳性率的分析，每组实验重复3次。

1.2.4 细胞免疫化学 收集细胞，调整细胞浓度为1×109·L-1取 100μl，800 r·min-1离心 5 min甩片。4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100破膜。分别加一抗GATA-1、PU.1于4℃孵育（湿盒）过夜，二抗工作液（湿盒）37℃ 孵育30 min。DAB显色10 min。苏木素复染，中性树胶封片，光学显微镜下观察阳性细胞染色程度。

1.2.5 Western blot法检测K562细胞内GATA-1、PU.1蛋白表达量 收集细胞，提取蛋白。将40μg的总蛋白混合上样缓冲液，100℃加热5 min使蛋白变性，10%SDS-PAGE胶分离，蛋白条带转到PVDF膜上，1%BSA封闭后，一抗4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，ECL显影，β-actin为内参蛋白。用计算机荧光扫描系统扫描并记录结果，以目的蛋白条带×灰度值／（内参蛋白×灰度值）的比值代表目的蛋白的表达水平，每组实验重复3次。

Fig 1 Res inhibited the colon number of K562 cell in semi-solid culture assay（n＝3）*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Fig 2 Expression of CD14，CD42b and CD11b in K562 cells by flow cytometryA：CD14；B：CD42b；C：CD11b

1.2.6 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行数据分析，计量资料以±s表示，加药组与对照组比较采用方差分析。

2 结果

2.1 白藜芦醇对K562细胞半固体集落生成的影响 不同剂量的白藜芦醇处理K562细胞6d后，随着剂量的增加，K562白血病细胞集落数明显低于实验对照组，呈一定的剂量依赖关系（Fig 1）P＜0.01。白藜芦醇 6.25、12.5、25、50和 100μmol·L-1组抑制率分别为13%±1.2%、28%±4%、53%±10%、63%±7%和90%±3%，均明显高于阴性对照组，P＜0.05或P＜0.01。

2.2 白藜芦醇提高K562细胞分化相关抗原阳性细胞的表达率 白藜芦醇处理K562细胞6 d后，流式细胞术检测K562细胞分化程度，结果显示白藜芦醇可诱导K562细胞分化相关抗原CD42b、CD11b和CD14的表达阳性率均明显高于对照组，且呈一定的剂量依赖关系（Fig 2）。

2.3 白藜芦醇对K562细胞中 GATA-1和PU.1蛋白表达水平的影响 不同浓度白藜芦醇处理K562细胞6d后，细胞免疫化学结果显示随着剂量的增加GATA-1和PU.1蛋白表达明显高于对照组（Fig 3，4）。Western blot法的结果与细胞免疫化学的结果基本一致，白藜芦醇处理后的K562细胞蛋白条带的灰度值明显高于对照组，P＜0.05或P＜0.01（Fig 5）。

Fig 3 Expressions of GATA-1 in K562 cells was detected with cell immunochemistry（400×）A：Control；B：Res 25μmol·L-1；C：Res 50μmol·L-1；D：Res 100μmol·L-1

3 讨论

Fig 4 Expressions of PU.1 in K562 cells was detected with cell immunochemistry（400×）A：Control；B：Res 25μmol·L-1；C：Res 50μmol·L-1；D：Res 100μmol·L-1

Fig 5 Expression of GATA-1 and PU.1 in K562 cells was anayzed with Western blot（A）K562 cells were treated with Res for 6 days，and the cell lysates were subjected to Western blot analysis for GATA-1 and PU.1.Beta-actin served as an equal loading control.Histograms（B）showed the relative expression of GATA-1 and PU.1（normalized to actin）as compared to the vehicle-treated cell.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.

目前临床上常用的白血病细胞分化诱导剂有维甲酸及其衍生物、砷剂等，但因其应用范围局限，毒副作用大，长期应用仍有争议。人髓系白血病K562细胞株在一定条件下可向红系、粒-单系和巨核系细胞分化，是研究白血病细胞增殖与分化的理想细胞模型。白黎芦醇作为新兴绿色保健药和抗癌药，已有报道发现［6-8］，白藜芦醇能够诱导白血病细胞凋亡和自噬。Yan等［9］采用白藜芦醇作用于K562白血病细胞株后，检测 GPA、HBA1、HBB和 γ-珠蛋白的表达，观察白藜芦醇诱导K562细胞向红系分化。本实验以白血病细胞分化相关转录因子GATA-1和PU.1蛋白及分化相关抗原为观察指标，观察白藜芦醇诱导K562细胞向红系、粒系和巨核系分化的作用。利用其多向分化的能力，主要观察Res抑制增殖，诱导白血病分化作用。结果显示白藜芦醇明显提高K562细胞分化相关抗原CD11b、粒-单系细胞分化抗原CD14、巨核系细胞分化抗原CD42b及红系特异性核转录因子GATA-1蛋白和转录因子PU.1蛋白的表达。提示白藜芦醇可能具有诱导白血病细胞株K562细胞向红系、粒系和巨核系分化的作用，其中诱导红系分化作用尤为明显。白藜芦醇诱导分化的作用机制仍需深入研究，为白藜芦醇今后的临床应用提供理论基础。

参考文献：

［1］ Jang M，Cai L，Udeani GO，et al.Cancer chemo preventive activity of resveratrol，a natural Product derived from grapes［J］.Science，1997，275（10）：218-20.

［2］ De Maria S，Scognamiglio I，Lombardi A，et al.Polydatin，a natural precursor of resveratrol，induces cell cycle arrest and differentiation of human colorectal Caco-2 cell［J］.J Transl Med，2013，11（1）：264.

［3］ 王 伟，李 覃，陈 虹，等.白藜芦醇调节STAT3抗急性髓性白血病作用的研究［J］.中国药理学通报，2010，26（3）：346-52.

［3］ Wang W，Li T，Chen H，et al.The study of resveratrol by modulating SATA3 on acute myeloblastic leukemia［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（3）：346-52.

［4］ Cao Y，Wang F，Liu H，et al.Resveratrol induces apoptosis and differentiation in acute promyelocytic leukemia（NB4）cells［J］.J Asian Nat Prod Res，2005，7（4）：633-41.

［5］ Burda P，Laslo P，Stopka T.The role of PU.1 and GATA-1 transcription factors during normal and leukemogenic hematopoiesis［J］.Leukemia，2010，24（7）：1249-57.

［6］ Su Y C，Li SC，Wu Y C，et al.Resveratrol downregulates interleukin-6-stimulated sonic hedgehog signaling in human acute myeloid leukemia［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013：547430.

［7］ Ge J，Liu Y，Li Q，et al.Resveratrol induces apoptosis and autophagy in T-cell acute lymphoblastic leukemia cells by inhibiting Akt／mTOR and activating p38-MAPK［J］.Biomed Environ Sci，2013，26（11）：902-11.

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［9］ Yan H W，Hu WX，Zhang JY，et al.Resveratrol induceshuman K562 cell apoptosis，erythroid differentiation，and autophagy［J］.Tumour Biol，2014，（DOI：10.1007／s13277-014-1701-y）