膜联蛋白A2对人宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和凋亡的影响

魏建勋， 马文君， 李红梅

(延安大学附属医院妇产科，陕西延安 716000)

膜联蛋白A2对人宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和凋亡的影响

魏建勋， 马文君， 李红梅△

(延安大学附属医院妇产科，陕西延安 716000)

目的：研究膜联蛋白A2(annexin A2，ANXA2)对人宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和凋亡能力的影响。方法：以HeLa细胞为研究对象，构建过表达载体以及ANXA2-siRNA，转染入细胞。将细胞分为正常对照组、scrambled组、ANXA2过表达组及ANXA2-siRNA组。应用real-time PCR法检测ANXA2 mRNA表达水平及Western blotting检测ANXA2蛋白表达水平。分别采用MTT法、Boyden小室法和流式细胞术观察ANXA2对HeLa细胞增殖、迁移及凋亡能力的影响。结果：ANXA2过表达组可以显著促进HeLa细胞的增殖和迁移;ANXA2-siRNA组明显抑制HeLa细胞的增殖和迁移;ANXA2对HeLa细胞凋亡几乎无影响。结论：沉默ANXA2对人宫颈癌细胞的凋亡无显著影响，但可显著抑制其增殖能力和迁移能力。ANXA2可能在宫颈癌的发生发展中具有十分重要的作用，提示它有可能成为宫颈癌治疗的分子靶点。

膜联蛋白A2;HeLa细胞;细胞增殖;细胞迁移;细胞凋亡

宫颈癌(cervical cancer)是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在妇女恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌［1］。随着人们对宫颈癌认识程度的不断加深，防癌普查的广泛开展以及治疗方法的不断改进，发病率和死亡率有所下降，但肿瘤局部未控、复发和转移仍是死亡的主要原因。目前随着分子生物学技术的发展，从基因表达水平研究宫颈癌的发生、发展、诊断及治疗已成为肿瘤研究的热点之一。膜联蛋白A2(annexin A2，ANXA2)是一种钙离子介导的磷脂结合特性的蛋白质，属于膜联蛋白家族成员，广泛分布于胞核、胞浆及细胞质膜外表面［2］。ANXA2作为生长调节因子，与一系列调控细胞生长和分裂的蛋白质相互作用而调控肿瘤生长［3］。ANXA2参与信号转导、细胞迁移、DNA的合成、细胞增殖与凋亡等，与肿瘤发生发展及恶性程度密切相关［4］。研究发现，ANXA2在大多数人类肿瘤，如脑癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌以及血液肿瘤表达均上调［5］，而在食管癌、前列腺癌、鼻咽癌中表达下调［6］。ANXA2的持续激活和异常表达与肿瘤增殖分化、细胞凋亡、新血管生成和免疫逃避密切相关，阻断ANXA2信号转导通路后，多种肿瘤细胞均出现增殖抑制、凋亡增加及侵袭力下降等现象［7］。本研究利用ANXA2基因转染和siRNA干扰技术刺激体外培养的宫颈癌细胞，观察ANXA2过表达和ANXA2-siRNA对宫颈癌细胞增殖、迁移、凋亡能力的变化，进一步明确ANXA2在宫颈癌细胞增殖、迁移、凋亡过程中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞 人宫颈癌细胞株HeLa，购自中国科学院上海细胞库，由本实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器 RPMI-1640培养基、胎牛血清、MTT、DMSO、TBST缓冲液和碘化丙啶(propidium iodide，PI)均购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司。CO2细胞培养箱(Thermo Forma)，酶联免疫检测仪(BioTek)，流式细胞仪(BD)，Bio-Rad iQ5实时定量PCR仪，激光共聚焦显微镜(Lavision)，ECL化学发光试剂盒(Fermentas)，BCA蛋白浓度测定试剂盒、RNAiso Plus kit、PrimeScript® RT reagent kit、SYBR® Premix Ex TaqTMII kit、限制性内切酶Nhe I、BamH I和T4连接酶(上海碧云天生物技术有限公司)，LipofectamineTMRNAiMAX和抗 ANXA2抗体(Santa Cruz)。

2 方法

2.1 ANXA2基因siRNA序列的设计及转染 siRNA片段由上海生工合成。靶向ANXA2的siRNA上游引物5’-GGGUCUGUCAAAGCCUAUAtt-3’，下游引物3’-ttACCCAGACAGUUUCGGAUA-5’。制备终浓度为80 nmol/L的siRNA-脂质体复合物，实验组加入ANXA2-siRNA混合物，同时设置空白对照组(control)。将HeLa细胞以2×105cells/well接种于6孔板，待细胞生长至70% ～80%时，更换无血清培养基，采用LipofectamineTM2000将ANXA2-siRNA转染细胞。

2.2 表达载体的构建 根据ANXA2序列设计合成一对分别位于ANXA2 cDNA序列上、下两侧的引物，中间包含有完整的ANXA2编码序列，上游引物5’-TATCGCTAGCCAGCTTCCTTCAAA-3’，含有Nhe I酶切位点;下游引物 5’-TGCGGGATCCATTTCTGGACGCTC-3’，含有BamH I酶切位点，引物采用Bioasia公司的自动DNA合成仪合成。提取HeLa细胞总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增后经Nhe I和BamH I酶切并与质粒pIRES2-GFP的酶切回收产物连接。连接产物经转化感受态大肠杆菌DH5α，涂平板筛选挑取阳性克隆，扩增后提取质粒，酶切产物经电泳观察基因片段的大小。然后挑选酶切鉴定符合的质粒送上海Invitrogen公司进一步测序鉴定。

2.3 RNA的提取与实时定量RT-PCR 以Trizol提取细胞总RNA，按照试剂盒要求操作。按照说明书进行反转录。ANXA2上游引物 5’-GAGGATGGCTCTGTCATTGATT-3’，下 游 引 物 5’-CTGGTAGTCGCCCTTAGTGTCT-3’，检测按实验室常规方法进行PCR扩增。PCR反应条件为:95℃预变性3 min、95℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环;72℃7 min。以ANXA2/β-actin进行定量分析，实验重复3次。

2.4 Western blotting 将培养的细胞用0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次后离心弃上清，加入含全酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液冰浴裂解提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。制备10%聚丙烯酰胺凝胶，冰浴进行电泳，电泳分离后用半干转法将蛋白转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后加稀释好的抗人ANXA2多克隆抗体4℃孵育过夜，次日PBS 1次、TBST 2次洗膜后加入辣根酶标记的Ⅱ抗室温孵育2 h。洗膜后ECL发光，X光片显影、定影、扫描仪扫描胶片。以β-actin作为内参照。

2.5 细胞增殖实验 取对数生长期细胞接种于96孔板，实验分为正常对照组、scramble组、ANXA2过表达组及ANXA2-siRNA组。细胞贴壁后，弃去旧培养基，加入无血清培养液，放入培养箱孵育24 h。取出培养板，每孔加20 μL MTT，放入培养箱中继续孵育4 h。小心吸弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min使紫色结晶充分溶解，酶标仪于490 nm处测定各孔A值，记录结果。

2.6 细胞迁移能力测定 将4组细胞(每组大约5×105个)分别悬浮在含有0.2%小牛血清的800 μL培养基中，依次接种至Boyden小室上层，培养6 h。收集迁移到滤膜下层的细胞，用甲醇固定，并通过HE染色来观察下层细胞的数量，最后通过计算滤膜下层的细胞数来评估其转移的细胞数量。

2.7 细胞凋亡测定 取对数生长期的HeLa细胞以1.5×105cells/well接种至 6孔板中，培养 24 h，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，1 000 r/min离心5min沉淀细胞，PBS洗涤2次后1 000 r/min离心沉淀细胞。将10×binding buffer稀释至1×binding buffer，每个样品加入300 μL 1×binding buffer，再加入5 μL Annexin V-FITC，室温避光染色30 min。每个样品加入5 μL PI，避光染色5 min后，再补加200 μL 1×binding buffer，吹打均匀后上机检测细胞凋亡情况。

3 统计学处理

以SPSS 16.0统计软件分析，数据以均数±标准差(mean±SD)，组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 ANXA2过表达载体或siRNA转染效果的鉴定

RT-PCR及Western blotting结果见图1，与对照组相比，scramble组HeLa细胞中ANXA2 mRNA及蛋白表达水平几乎无变化，而ANXA2过表达组mRNA及蛋白表达水平显著升高，ANXA2-siRNA组mRNA及蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)。

Figure 1.The transfection efficiency of ANXA2 overexpression vector or siRNA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图1 ANXA2过表达载体或siRNA的转染效果

2 ANXA2对HeLa细胞增殖的影响

MTT法测定结果见图2，与对照组和scramble组相比，ANXA2过表达组可以显著促进HeLa细胞的增殖，ANXA2-siRNA转染组细胞的增殖受到明显的抑制(P＜0.05)，而对照组和scramble组中HeLa细胞增殖的差异无统计学意义(P＞0.05)，提示沉默ANXA2能够抑制宫颈癌HeLa细胞增殖。

Figure 2.Effect of ANXA2 on HeLa cell proliferation.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图2 ANXA2对HeLa细胞增殖的影响

3 ANXA2对HeLa细胞迁移的影响

对照组和 scramble组细胞发生迁移数分别为(78.0±5.0)个和(75.0±4.1)个，差异无统计学意义(P＞0.05)，ANXA2过表达组细胞发生迁移数为(123.0±4.7)个，明显高于对照组，而ANXA2-siRNA转染组细胞发生迁移数为(39.0±3.9)个，明显低于对照组(P＜0.05)，见图3，表明沉默ANXA2能够抑制宫颈癌HeLa细胞的迁移能力。

Figure 3.Effect of ANXA2 on HeLa cell migration.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图3 ANXA2对HeLa细胞迁移的影响

4 ANXA2对HeLa细胞凋亡的影响

流式细胞术检测细胞凋亡结果见图4，与对照组和scramble组相比，ANXA2过表达组和ANXA2-siRNA转染组对HeLa细胞的凋亡无显著影响，表明ANXA2不参与调控宫颈癌HeLa细胞的凋亡。

讨论

Figure 4.Effect of ANXA2 on HeLa cell apoptosis.图4 ANXA2对HeLa细胞凋亡的影响

宫颈癌的发病与多因素的参与有关，但是具体发病机制至今仍不清楚，宫颈癌的发生发展与各种基因突变及基因表达紊乱密切相关［8-9］。而肿瘤的侵袭转移是一个多因素、多步骤的复杂过程，涉及到肿瘤细胞与宿主之间复杂的相互作用，多种基因及其产物参与这一过程的调控。ANXA2在细胞内参与膜形成、膜转运、胞吞、胞吐、细胞增殖、信号转导、分化及凋亡等一系列重要的生命过程。ANXA2在肿瘤中的异常表达与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移及预后密切相关［10-11］。研究表明，上调ANXA2基因表达可促进人乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力［12］。对人肝癌细胞的研究发现，ANXA2干扰siRNA可以抑制人肝癌细胞的迁移和侵袭［13］。对宫颈癌细胞的研究发现，ANXA2表达水平低的患者对新辅助化疗敏感性增加，表明ANXA2可能是诱导宫颈癌患者抵抗新辅助化疗的一个重要因子，同时，宫颈癌患者基质细胞中ANXA2表达水平高，则生存率降低［14］。但是，关于ANXA2在宫颈癌HeLa细胞发生发展过程中的作用尚未见报道。

本研究通过ANXA2干扰siRNA和ANXA2过表达载体探讨了ANXA2对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和凋亡能力的影响。我们的研究结果表明，ANXA2对HeLa细胞凋亡基本无影响，沉默ANXA2基因能够降低HeLa细胞的增殖、迁移能力;ANXA2过表达能够增强HeLa细胞的增殖、迁移能力。本实验结果提示，宫颈癌HeLa细胞与生长因子ANXA2的高表达密切相关，ANXA2可以成为宫颈癌治疗的一个新靶点。虽然本研究证实了ANXA2在宫颈癌中发挥着重要作用，但是确切的信号途径尚不清楚，有待于进一步探讨。

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Effect of annexin A2 on proliferation，migration and apoptosis of human cervical cancer HeLa cells

WEI Jian-xun，MA Wen-jun，LI Hong-mei
(Department of Obstetrics and Gynaecology，Affiliated Hospital of Yanan University，Yanan 716000，China.E-mail:submission029@gmail.com)

AIM:To explore the effect of annexin A2(ANXA2)on the proliferation，migration and apoptosis abilities of human cervical cancer HeLa cells.METHODS:Overexpression vectors and siRNA of ANXA2 were constructed，and then transfected into HeLa cells.The HeLa cells were divided into 4 groups:control group，scramble group，ANXA2 overexpression group and ANXA2-siRNA group.The expression of ANXA2 at mRNA and protein levels was examined by real-time PCR and Western blotting.MTT assay，Boyden chamber and flow cytometry were used to determine the effect of ANXA2 on the proliferation，migration and apoptosis abilities of the HeLa cells.RESULTS:The proliferation and migration of HeLa cells were obviously promoted by ANXA2 overexpression.The proliferation and migration of HeLa cells were remarkably inhibited by the transfection of ANXA2-siRNA.ANXA2 had no effect on apoptosis of HeLa cells.CONCLUSION:Silencing of ANXA2 effectively inhibits the proliferation and migration of cervical cancer cells，but has little effect on apoptosis.ANXA2 may play a pivotal role in the occurrence and development of cervical cancer，and may be used as a molecular target for the treatment of cervical cancer.

Annexin A2;HeLa cells;Cell proliferation;Cell migration;Apoptosis

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.029

1000-4718(2014)03-0547-04

2013-10-31

2014-01-13

△通信作者Tel:0911-2881213;E-mail:submission029@gmail.com