鳖甲煎丸对大鼠长期毒性的实验研究

熊婧，李霞，曾凡波，陈鹏，翟莉

(1.武汉健民药业集团股份有限公司，武汉 430052；2.华中科技大学同济医学院药学院，武汉 430030)

鳖甲煎丸对大鼠长期毒性的实验研究

熊婧1，李霞1，曾凡波2，陈鹏1，翟莉1

(1.武汉健民药业集团股份有限公司，武汉 430052；2.华中科技大学同济医学院药学院，武汉 430030)

目的 观察鳖甲煎丸对大鼠的毒性反应,确定其安全剂量,为拟定人用剂量提供参考。方法SD大鼠60只,随机分为鳖甲煎丸低、高剂量组和对照组,每组20只,分别灌胃给予低、高剂量鳖甲煎丸药液(相当于生药5, 10 g·kg-1)和纯化水2mL,连续给予6个月。观察大鼠一般状况、体质量及进食量,给药结束及停药4周后检查血常规、血液生化学指标及脏器系数、组织病理学变化。结果鳖甲煎丸低、高剂量组大鼠一般状况、体质量、进食量、血常规、血液生化学指标及脏器系数与对照组比较均差异无统计学意义,亦未见异常组织病理学变化。结论鳖甲煎丸对大鼠血常规、血液生化学指标无明显影响,对脏器的长期毒性低,未发现毒性靶器官,长期服用安全。

鳖甲煎丸；毒性,长期；大鼠

鳖甲煎丸源于张仲景《金匮要略·疟症》篇,具活血化瘀、软坚散结之功效,用于胁下癥块［1-3］。临床上除用于治疗因疟疾等各种原因引起的肝脾大、肝硬化等症外,也用于恶性肿瘤的治疗,且在治疗子宫肌瘤、黄褐斑、心绞痛及高脂血症等方面亦取得较好疗效［3］,但对鳖甲煎丸的长期毒性研究笔者鲜见报道。为探讨鳖甲煎丸长期服用安全性,观察其毒性反应的靶器官及其损害的可逆性,笔者对其进行了长期毒性实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 受试药物与试剂 鳖甲煎丸由武汉中联药业集团股份有限公司提供(批号:100160),实验前用纯化水配制成不同浓度的药液,备用。总蛋白(total protein,TP)检测试剂盒(批号:101014)、清蛋白(albumin,ALB)检测试剂盒(批号:101003)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)检测试剂盒(批号:101101)、血清尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)检测试剂盒(批号:101005)、肌酐(creatinine, Crea)检测试剂盒(批号:101008),均由北京化工厂生产；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒(批号:100916),血糖(blood glucose,GlU)检测试剂盒(批号:100925),总胆固醇(total cholesterol,TC)检测试剂盒(批号:101102),均由上海荣盛生物技术有限公司生产。

1.1.2 仪器 Hematology Analyzer-Mek-5108kg型自动检测仪。

1.1.3 实验动物 纯种SD大鼠,5～6周龄,体质量(80±10)g,雌雄各半,购于湖北省实验动物研究中心,实验动物生产许可证号:SCXK(鄂)2008-0005,实验动物合格证号:湖北省医学实验动物字第19-053号,清洁(Ⅱ)级。实验前1周进入实验室,按正常供食(普通鼠饲料)、供水饲养,室温(25±2)℃,空气湿度50%～65%,以适应本实验室环境。实验动物使用许可证号:SYXK(鄂)2008-0009。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 取纯种SD大鼠60只,随机分为3组,每组20只,分别为对照组、鳖甲煎丸低剂量组(生药5 g·kg-1,相当于人用量的16.5倍)、鳖甲煎丸高剂量组(生药10 g·kg-1,相当于人用量的33.0倍)。对照组每只给予纯化水2 mL灌服；鳖甲煎丸低、高剂量组分别灌服相应剂量浓度的药液,每只灌服体积为2 m L,并每周称大鼠体质量,按大鼠体质量变化调整给药量,以保证低、高剂量组的给药剂量。各组每日以等体积给药1次,连续给药6个月。按观察指标中的要求检测各项指标［4］。

1.2.2 大鼠一般状况、体质量及进食量观察 在用药期间逐日观察大鼠进食量,外观体征和行为活动,粪便性状,每周称体质量一次并观察动物皮毛。发现中毒反应的动物取出单笼饲养,发现死亡或濒临死亡动物,及时尸检。

1.2.3 血常规检查 在实验中期(90 d)、实验结束(180 d)和停药14 d后,检查血常规,即外周血中的红细胞计数、血红蛋白(hemoglobin,HB)含量测定、白细胞计数及分类。

1.2.4 血液生化学检查 在实验中期与结束和停药14 d后,分别取大鼠血样测定TP、ALB、GLU、ALP、ALT、Crea、TC、BUN。

1.2.5 系统尸检、脏器系数及组织病理学检查 在实验结束时,各组通过断颈处死(尸检前称体质量)1/2的动物,全面细致观察动物的脑、心、肝、肺、脾、肾、胃、肠、甲状腺、肾上腺、睾丸、子宫、卵巢等主要脏器,并称各脏器质量,计算动物各脏器质量与体质量之比(脏器系数)。另在各组动物已处死作尸检的基础上,每组各取5只动物的心、肝、肾、脾、肺、胃以10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,切片,苏木精-伊红(hematoxylineosinstaining,HE)染色,光镜观察组织学变化,并对各组的组织学变化进行统计分析处理,判断组间差异。

1.2.6 恢复性观察 各组在停药28 d后,对余下动物作上述各项指标检查,对各主要脏器进行尸检与脏器系数测定,以观察毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟毒性。

2 结果

2.1 对大鼠一般状况、体质量及进食量的影响 实验期间各组动物毛色光滑、活动自如、摄食、饮水、粪便均正常,生长发育良好,未发现中毒现象。给药前各组动物体质量差异无统计学意义(P>0.05)；给药期间各组动物体质量逐周增加,实验结束后各组之间的体质量变化差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1,2。

2.2 对大鼠血常规及血液生化学指标的影响 在不同时期检查血常规,各组之间的血常规、血液生化学指标均差异无统计学意义(P>0.05),并均在正常值范围内。结果见表3,4。

2.3 对大鼠脏器系数及组织病理学的影响 实验结束及停药4周后各组动物处死解剖,脑、心、肝、脾、肺、胃、肠、肾、肾上腺、甲状腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫等主要脏器的大小、形状、颜色、质地均正常,肉眼未发现可见病变,各组脏器系数［g·(100 g)-1］均差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表5。组织病理学观察显示,鳖甲煎丸低、高剂量组与对照组比较,给药期被检脏器组织结构、细胞形态均未发现明显由药物引起的病理改变,恢复期后亦未发现明显延迟毒性反应,提示鳖甲煎丸对大鼠主要脏器无明显损害和毒性反应。

表1 3组大鼠(雄性)实验期间的体质量比较Tab.1 Comparison of body weight am ong three groups of rats(male)during the experim ent g,±s

表1 3组大鼠(雄性)实验期间的体质量比较Tab.1 Comparison of body weight am ong three groups of rats(male)during the experim ent g,±s

组别大鼠/只实验前第2周第4周第6周第8周第10周第12周鳖甲煎丸低剂量组20 84.5±3.9 106.4±7.4 119.7±7.6 136.8±7.9 157.4±9.5 186.5±19.8 221.6±23.4高剂量组20 86.3±4.6 104.5±5.7 120.5±8.5 137.7±7.9 158.4±11.7 181.2±21.5 220.4±22.5对照组20 85.4±3.8 102.5±6.3 118.5±7.5 138.6±8.9 158.6±10.5 185.5±22.1 224.3±25.1组别第14周第16周第18周第20周第22周第24周第28周鳖甲煎丸低剂量组249.7±23.5 263.5±23.9 276.4±33.3 286.5±37.6 296.7±37.9 320.1±35.5 359.4±43.4高剂量组249.1±21.3 259.3±24.1 274.3±35.7 280.5±29.5 301.1±36.9 318.3±31.7 351.5±51.4对照组253.6±24.7 267.6±26.3 271.5±31.5 280.4±32.9 308.4±35.6 325.4±31.4 354.7±54.6

表2 3组大鼠(雌性)实验期间的体质量比较Tab.2 Comparison of body weight among th ree groups of rats(female)during the experim ent g,±s

表2 3组大鼠(雌性)实验期间的体质量比较Tab.2 Comparison of body weight among th ree groups of rats(female)during the experim ent g,±s

组别大鼠/只实验前第2周第4周第6周第8周第10周第12周鳖甲煎丸低剂量组20 76.4±5.1 86.7±6.3 102.5±7.7 120.6±9.1 129.6±10.5 136.8±11.5 155.8±19.5高剂量组20 76.4±4.7 84.6±6.6 101.3±7.4 120.1±7.7 129.5±10.1 139.6±18.6 159.3±21.1对照组20 75.5±4.7 82.3±4.6 98.6±6.6 118.8±8.7 127.3±11.4 135.7±12.4 154.6±18.6组别第14周第16周第18周第20周第22周第24周第28周鳖甲煎丸低剂量组185.6±20.1 210.6±20.1 223.1±21.4 239.4±22.8 256.3±30.1 268.5±30.4 289.8±37.1高剂量组189.2±22.1 209.6±22.1 220.1±21.1 238.9±19.6 258.2±31.7 271.5±30.6 295.6±39.7对照组183.5±21.3 206.4±21.8 219.6±26.3 235.3±28.7 252.6±31.7 269.1±33.7 287.6±41.3

表3 3组大鼠实验期间红细胞、白细胞、HB、多核细胞和淋巴细胞的变化Tab.3 Changes of red blood cells,white blood cells,HB,multinucleated cells and lym phocytes in three groups rats during the experiment ±s

表3 3组大鼠实验期间红细胞、白细胞、HB、多核细胞和淋巴细胞的变化Tab.3 Changes of red blood cells,white blood cells,HB,multinucleated cells and lym phocytes in three groups rats during the experiment ±s

组别与时间大鼠/只红细胞/ (×1012·L-1)白细胞/ (×109·L-1) HB/ (g·L-1)多核细胞/ %淋巴细胞/ %鳖甲煎丸低剂量组20给药90 d 7.63±0.63 12.05±3.46 11.94±1.42 19.63±4.86 80.37±7.85给药180 d 8.53±0.75 11.94±2.56 11.73±1.41 18.94±5.77 81.06±7.75停药14 d 8.94±0.64 11.83±3.51 11.96±1.49 19.74±3.84 80.26±8.37鳖甲煎丸高剂量组20给药90 d 7.51±0.55 12.06±2.42 12.64±1.95 20.76±4.98 79.24±8.73给药180 d 8.28±0.36 11.41±3.75 11.65±1.72 19.52±5.32 80.48±9.32停药14 d 8.51±0.55 12.69±4.02 12.28±1.21 19.56±3.85 80.44±8.33对照组20给药90 d 7.84±0.54 11.64±2.45 12.47±1.25 20.68±5.64 79.32±8.35给药180 d 8.45±0.68 12.83±3.45 11.65±1.31 19.79±4.86 80.21±8.63停药14 d 8.46±0.74 12.54±4.15 12.06±1.63 19.12±4.24 80.88±9.37

表4 3组大鼠实验期间血液生化学指标的变化Tab.4 Changes of blood biochem istry in three groups rats during the experiment ±s

表4 3组大鼠实验期间血液生化学指标的变化Tab.4 Changes of blood biochem istry in three groups rats during the experiment ±s

组别与时间大鼠/只AST ALP (U·L-1) TP ALB (g·L-1)鳖甲煎丸低剂量组20给药90 d 39.5±9.7 108.3±16.4 62.6±3.2 47.7±4.6给药180 d 41.8±11.2 101.5±12.4 67.4±4.2 49.2±5.1停药14 d 40.9±10.6 103.5±13.7 68.3±5.2 51.9±4.9鳖甲煎丸高剂量组20给药90 d 40.8±12.7 113.7±17.3 68.5±4.7 44.7±5.3给药180 d 41.7±11.3 107.3±12.4 66.9±4.7 47.3±4.2停药14 d 40.1±10.3 102.4±10.4 66.2±4.9 52.1±4.7对照组20给药90 d 41.3±12.5 110.6±18.5 66.4±4.1 46.3±3.6给药180 d 40.6±11.4 103.4±11.4 65.7±3.9 48.2±4.1停药14 d 41.5±10.4 100.8±14.5 66.3±4.4 51.1±5.6

续表4 3组大鼠实验期间血液生化学指标的变化Tab.4 Changes of blood biochem istry in three groups rats du ring the experiment ±s

续表4 3组大鼠实验期间血液生化学指标的变化Tab.4 Changes of blood biochem istry in three groups rats du ring the experiment ±s

组别与时间GLU BUN TC (mmol·L-1) Crea/ (μmol·L-1)鳖甲煎丸低剂量组给药90 d 5.3±0.6 8.3±0.6 2.4±0.6 56.2±7.3给药180 d 5.3±0.5 8.0±0.6 2.2±0.4 54.6±6.8停药14 d 5.2±0.5 8.7±0.6 2.3±0.4 55.6±6.6鳖甲煎丸高剂量组给药90 d 5.1±0.5 8.3±0.6 2.4±0.6 53.5±5.7给药180 d 5.2±0.5 8.3±0.6 2.3±0.3 56.7±6.1停药14 d 5.2±0.5 8.2±0.6 2.2±0.4 58.4±7.3对照组给药90 d 5.4±0.6 8.3±0.7 2.6±0.6 59.4±8.3给药180 d 5.2±0.5 7.9±0.5 2.5±0.5 58.3±7.4停药14 d 5.1±0.6 8.4±0.6 2.4±0.5 57.5±7.7

表5 3组大鼠主要脏器系数比较Tab.5 Comparison ofmain organ coefficient among three groups of rats ±s

表5 3组大鼠主要脏器系数比较Tab.5 Comparison ofmain organ coefficient among three groups of rats ±s

组别大鼠/只脑心肝脾肺肾睾丸(雄性)鳖甲煎丸低剂量组10 0.52±0.05 0.36±0.05 3.39±0.73 0.33±0.04 0.77±0.09 0.83±0.12 0.67±0.16高剂量组10 0.53±0.05 0.35±0.06 3.41±0.69 0.33±0.05 0.78±0.12 0.83±0.11 0.68±0.15对照组10 0.53±0.04 0.35±0.06 3.41±0.77 0.34±0.05 0.78±0.11 0.82±0.13 0.68±0.18组别附睾(雄性)卵巢(雌性)子宫(雌性)前列腺(雄性)肾上腺甲状腺胸腺鳖甲煎丸低剂量组0.16±0.02 0.08±0.01 0.23±0.06 0.16±0.03 0.00±0.00 0.03±0.01 0.00±0.00高剂量组0.15±0.02 0.08±0.01 0.24±0.05 0.16±0.03 0.00±0.00 0.03±0.01 0.00±0.00对照组0.15±0.02 0.08±0.01 0.24±0.05 0.16±0.02 0.00±0.00 0.03±0.01 0.00±0.00

3 讨论

鳖甲煎丸低、高剂量组(生药5,10 g·kg-1,分别相当于人用量的16.5倍和33.0倍)连续灌胃给药180 d及停药28 d,各剂量组雌、雄大鼠体质量增长正常,饮水、进食量及一般状况与对照组比较均差异无统计学意义(P>0.05),提示鳖甲煎丸不影响大鼠生长发育；鳖甲煎丸低、高剂量组的血常规及血液生化学指标与对照组比较均差异无统计学意义(P>0.05),提示鳖甲煎丸不影响大鼠骨髓造血功能,对肝肾功能亦无损害,不影响肝对蛋白质、糖的代谢和肾的排泄功能；主要脏器系数及组织病理学检查均无明显差异和异常变化,提示鳖甲煎丸对大鼠主要脏器质量和脏器系数无明显影响。

综上所述,在本实验条件下对大鼠连续灌胃给药180 d及停药28 d后,大鼠的一般状况、体质量变化、血常规、血液生化学、脏器系数、组织病理学检查均未见药物引起的毒性反应和延迟毒性反应,表明鳖甲煎丸对实验大鼠无明显长期毒性作用。提示大鼠连续灌胃鳖甲煎丸180 d的安全剂量为生药10 g·kg-1(相当于人用量的33.0倍)。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:人民卫生出版社,1985:477.

［2］董超,司秋菊,王贵娟.鳖甲煎丸的临床应用与实验研究进展[J].时珍国医国药,2009,20(10):2551.

［3］王贵娟,司秋菊,王兴华.鳖甲煎丸现代药理研究进展[J].中成药,2009,31(9):1422.

［4］中华人民共和国卫生部药政管理局.中药新药研究指南[M].北京:人民卫生出版社,1994:205-207.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.006

Long-term Toxicity Tests of Biejiajian Pills in Rats

XIONG Jing1,LIXia1,ZENG Fan-bo2,CHEN Peng1,ZHAILi1
(1.Wuhan Jianmin Pharmaceutical Groups Co.,Ltd.,Wuhan 430052,China;2.School of Pharmacy,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030 China)

Objective To study the long-term toxicity ofbiejiajianpills in rats,determine the safe dose,and provide reference for human use.MethodsSixty SD rats were divided into low,high dose groups,and control group,respectively (n=20 in each group),biejiajianpillswere orally administered to rats at the doses of5 and 10 g·kg-1daily for 6 months,while the control group was given with 2mLofdistilled water only.The general state,bodymass and food intakeweremeasured.By the end of the testand 4 weeks after drugwithdrawal,blood routine,hematologic and biochemical examination,organ coefficient,and histopathology were tested.ResultsCompared with the control group,no significant differences in all checked items were found in the treatment groups.ConclusionBiejiajianpills have a low long-term toxicity on the organs,blood routine, hematologic and biochemical indicators.The organ specific toxicity ofbiejiajianpills is not found.Biejiajianpill at tested doses is safe for oral use in rats.

Biejiajianpill;Toxicity,Long-term;Rats

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)01-0020-04

2012-08-01

2013-06-27

熊婧(1985-),女,湖北武汉人,助理工程师,主要从事中药技术开发工作。电话：027-84523351,E-mail：305836524@qq.com。

陈鹏(1978-),女,湖北武汉人,工程师,主要从事中药新药研发工作。电话：027-84514002,E-mail：610664040@qq.com。