液相色谱-质谱联用法检测壮阳类中成药中西地那非的含量*

邓银华,章为

(1.湖南省人民医院药学部,长沙 410005;2.湖南省食品药品检验研究所,长沙 410001)

液相色谱-质谱联用法检测壮阳类中成药中西地那非的含量*

邓银华1,章为2

(1.湖南省人民医院药学部,长沙 410005;2.湖南省食品药品检验研究所,长沙 410001)

目的 建立液相色谱-质谱联用(LC-MS)法检测壮阳类中成药中非法添加西地那非含量的方法。方法采用Waters BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),流动相:含0.1%醋酸的0.02 mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈(70∶30),流速为0.2 mL·min-1,柱温为35℃;质谱采用电喷雾离子源,多反应监测模式(正离子),两通道475→100,475→283。结果西地那非在0.198 6～1.986 ng内线性关系良好,回归方程为Y=27 750X+15 232(r=0.995 2),平均回收率为96.6%,RSD为1.8%(n=9),分析方法的定量下限为0.04 ng,检测限为0.01 ng。10批样品中有4批检测出非法添加了西地那非,含量为每次服用量25或50 mg。结论该方法灵敏度高,结果准确可靠,适用于壮阳类中成药中非法添加西地那非的含量检测。

西地那非;液相色谱-质谱联用;多反应监测

一些不法生产者擅自在中成药中添加化学药成分以达到壮阳类药物快速起效的效果[1-2]。非法添加的化学成分中可能携带制备过程中未除去的杂质[3],并未能通过有效的方法加以检出、控制,可能给使用者造成直接或潜在的危害。因此,必须建立完整的违禁药物监测体系,保证患者的用药安全。既往研究常采用常规配备光学检测器的色谱检测,只能提供相对保留时间,难以独立确证检测结果[4-10]。笔者在本研究建立液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)法快速检测壮阳类中成药中非法添加西地那非含量的方法,以质谱仪作为检测器的LCMS检测系统分析的是化合物结构相关的信息,如相对分子质量、特征碎片等,结果专属性强,定性、定量更准确。本次实验共抽检10批样品,有4批检出非法添加枸橼酸西地那非,报道如下。

1 试药与仪器

1.1 试药 乙腈(HPLC级,默克公司,批号:1489730-925),乙酸铵(分析纯,国药集团化学试剂有限公司,批号:F20120818),水为超纯水;枸橼酸西地那非对照品(Toronto Reaearch Chemicals Inc.,Cat#S435000,批号:3-ARP-69-1);壮阳类中成药10批,均为市售品。

1.2 仪器 Waters Alliance-Quattro Micro液相色谱-质谱联用仪(美国Waters公司),色谱柱为Waters BEH C18键合硅胶柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);SB-5200DTN超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司); R200D型电子分析天平(德国赛多利斯公司);CH80-2台式低速离心机(上海优浦科学仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取枸橼酸西地那非对照品9.93 mg,置50 mL量瓶中,加乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀,取1.0 mL,置50 mL量瓶中,加50%乙腈溶液稀释至刻度,摇匀,制成3 972 ng·mL-1的储备液,备用。

2.2 供试品溶液制备 取供试品一次服用量,置于50 mL量瓶中,加乙腈40 mL,超声提取15 min,放冷至室温,用乙腈稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液1.0 mL,置50 mL量瓶中,加50%乙腈溶液稀释至刻度,摇匀,即得。

2.3 色谱-质谱条件及系统适用性实验

2.3.1 色谱条件 色谱柱:Waters BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相:含0.1%乙酸的0.02 mol·L-1乙酸铵溶液-乙腈(70∶30);流速: 0.2 mL·min-1;柱温:35℃;进样量:5 μL。

2.3.2 质谱条件 模式为电喷雾离子化(Electrospray ionization,ESI)方式,MRM,检测离子为正离子,两通道475→100,475→283。干燥气流量为500 L·h-1,雾化气流量为50 L·h-1,电离电压:3.0 kV;导入电压: 3 V;离子源温度:120℃;干燥气温度:350℃;碰撞室气体:氩气;通道475→100碰撞能量:25 V;通道475→283碰撞能量:33 V。

2.3.3 系统适用性实验 取“2.1”和“2.2”项对照品溶液和供试品溶液,按照“2.3.1”项色谱条件和“2.3.2”质谱条件进样检测,结果LC-MS图谱见图1。

2.4 线性关系考察和定量下限的确证 用对照品储备液配制浓度分别为39.72,79.44,158.88,198.6, 397.2 ng·mL-1的对照品溶液,分别精密吸取各5 μL,注入LC-MS仪,测定西地那非MRM 475→100的峰面积。以对照品进样量(ng)为横坐标,色谱峰峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程为Y=27 750X+ 15 232(r=0.995 2),西地那非进样量在0.198 6～1.986 ng范围内线性关系良好。定量下限为0.04 ng (S/N=15),检测限为0.01 ng(S/N=5)。

2.5 重复性实验 精密吸取“2.2”项下的供试品溶液5 μL,按“2.3”项色谱质谱条件,连续进样5次,测定西地那非色谱峰峰面积,计算RSD为2.25%(n=5)。

2.6 稳定性实验 精密吸取“2.2”项下的供试品溶液5 μL,分别于制备后0,2,4,6,8,10,12 h进样,测定西地那非的色谱峰峰面积,计算RSD为1.92%。表明溶液在室温放置12 h内基本稳定。

2.7 回收率实验 取同一已知含量供试品(西地那非未检出)9份,分别置50 mL量瓶中,分为3批,每批3份,各分别加入39.72,198.60和397.20 ng·mL-1的对照品溶液5 mL,按“2.2”项方法制得低、中、高3种浓度供试品溶液,分别精密吸取5 μL,注入液相色谱仪,测定色谱峰峰面积。将加样供试品中西地那非峰面积除以相应浓度的对照品溶液峰面积计算回收率,结果低、中、高浓度回收率分别为95.8%,95.4%, 98.5%,平均96.6%,RSD=1.8%。

A.对照品(475→100);B.对照品(475→283);C.供试品(475→100);D.供试品(475→283)图1 对照品和供试品的LC-MS图A.reference substance(475→100);B.reference substance(475→283);C.sample(475→100);D.sample(475→283)Fig.1 LC-MS chromatogram of reference substance and sample

2.8 耐用性实验 实验中比较3种不同类型的色谱柱:Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)、WatersHSS C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Agilent ZORBAX C18(50 mm×2.1 mm,1.8 μm),结果供试品溶液在这3种色谱柱上均能得到很好的结果。柱温分别为35和45℃时,供试品溶液均能得到很好的效果。

2.9 样品含量测定 取供试品一次服用量,置50 mL量瓶中,按“2.2”项方法制备供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各5 μL,注入液相色谱仪,测定西地那非MRM 475→100的峰面积,按外标法计算样品中西地那非浓度,进一步换算为每次服用量中西地那非的含量。结果10批样品中有4批检测出非法添加西地那非,含量为每次服用量25或50 mg。

3 讨论

中成药中非法添加的化学药成分不但涉嫌不正当竞争,而且其中可能携带制备过程中未除去的杂质,将给使用者造成直接或潜在的危害。因此,加强中成药质量监管,建立准确有效的违禁药物检测技术,对保障患者的身体健康具有重要意义。

笔者在本研究建立LC-MS多反应监测法检测壮阳类中成药中非法添加西地那非的含量。实验结果表明,样品中杂质对西地那非无干扰,样品峰形良好,并且样品前处理程序简单,结果准确,专属性好,灵敏度高。本方法为打击壮阳类中成药中非法添加西地那非提供良好、可行的技术支持。

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[3] 刘莉,周世玉,程龙琼.补肾壮阳类中成药中西地那非等的快速检测[J].医药导报,2012,31(4):507-509.

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.032

Quantitative Determination of Sildenafil in Aphrodisiacs by LC-MS

DENG Yin-hua1,ZHANG Wei2
(1.Department of Pharmacy,People’s Hospital of Hunan Province,Changsha 410005,China;2.Hunan Institute for Food and Drug Control,Changsha 410001,China)

ObjectiveTo establish a method for the quantitative determination of sildenafil in aphrodisiacs by liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS).MethodsChromatography was carried on a Waters BEH C18column(50 mm× 2.1 mm,1.7 μm)with the column temperature being 35℃and 0.02 mol·L-1ammonium acetate water solution(containing 0.1%acetic acid)-acetonitril(70∶30)as the mobile phase at a flow rate of 0.2 mL·min-1.Determination was performed by multiple reaction monitoring mode in two channels,475→100,475→283,using electrospray ionization in positive ion mode.ResultsSildenafil had a good linear relationship in the range of 0.1986-1.986 ng with the linear regression equation beingY= 27 750X+15 232(r=0.995 2).The average recovery was 96.6%with RSD being 1.8%(n=9).The limits of quantitation and detection were 0.04 ng and 0.01 ng,respectively.ConclusionThe determination results of 10 batches of samples show that the method is sensitive and accurate and can be used as an appropriate technique to detect sildenafil in aphrodisiacs.

Sildenafil;Liquid chromatography-mass spectrometry;Multiple reaction monitoring

R983;R927.2

B

1004-0781(2014)10-1373-03

2013-10-27

2014-04-09

*湖南省卫生厅资助项目(C2012-13)

邓银华(1980-),女,湖南邵阳人,主管药师,硕士,研究方向:药品分析及质量控制等。电话:0731-83929301, E-mail:dengyinhua@sina.com。