超高效液相色谱法测定藿香正气口服液中香豆素类成分的含量

何丹,杨林,张景勍

(1.重庆医科大学药学院,重庆 400016;2.重庆医药高等专科学校药学院,重庆 401331)

超高效液相色谱法测定藿香正气口服液中香豆素类成分的含量

何丹1,杨林2,张景勍1

(1.重庆医科大学药学院,重庆 400016;2.重庆医药高等专科学校药学院,重庆 401331)

目的 建立以超高效液相色谱法(UPLC)测定藿香正气口服液中欧前胡素和异欧前胡素含量的方法。方法色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),流动相为水-甲醇不同比例梯度洗脱,柱温30℃,流速0.3 mL·min-1,检测波长为248 nm。结果欧前胡素在1.305～13.050 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好,回归方程:Y=13 633X+3 976(r=0.999 9),平均回收率为99.25%,RSD=0.74%;异欧前胡素在0.596～5.960 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好,回归方程:Y=10 661X+1 073(r=0.999 9),平均回收率为98.94%,RSD=0.63%。结论该方法准确、快速、可靠,能有效地测定藿香正气口服液中欧前胡素和异欧前胡素的含量。

藿香正气口服液;欧前胡素;异欧前胡素;色谱法,超高效液相

藿香正气口服液是由苍术、陈皮、厚朴、白芷等10味中药制成的复方口服制剂,具有解表化湿、理气和中之功效。用于外感风寒、内伤湿滞,夏伤暑湿,头痛昏重,脘腹胀痛,呕吐泄泻,胃肠型感冒[1]。2010年版《中华人民共和国药典》中藿香正气口服液中含量测定项规定对厚朴酚与和厚朴酚和橙皮苷进行含量测定,作为质量控制指标[1]。目前对“藿香正气”类制剂含量测定方法多见于采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法对厚朴酚、和厚朴酚、陈皮苷及百秋李醇进行测定[2-5]。笔者未见对处方中白芷药材中的香豆素类成分的含量进行测定的报道。由于香豆素类成分是白芷药材中含量较高的活性成分之一,主要含欧前胡素和异欧前胡素,药理活性明确,故是判别白芷药材质量优劣的重要依据[6]。目前关于中药材及中成药中欧前胡素和异欧前胡素测定方法的文献报道主要有薄层扫描法和HPLC法[6-8],笔者未见采用超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)法进行测定。笔者采用UPLC法对藿香正气口服液中的欧前胡素和异欧前胡素进行含量测定的报道。该方法高效、快速,重复性和精密度良好,适用于藿香正气口服液中欧前胡素和异欧前胡素的测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters ACQUITY UPLC(美国Waters公司);ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)色谱柱(美国Waters公司)。

1.2 试药 藿香正气口服液(太极集团重庆涪陵制药厂,批号:11071571,11122024,12061274);欧前胡素对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110826-201013);异欧前胡素对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110827-200407);甲醇为色谱纯(山东禹王实业总公司化工厂),实验用水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);柱温:30℃;为避免样品的相互干扰以及保护色谱柱,采用水-甲醇为流动相,按表1所示梯度洗脱;检测波长248 nm;流速0.3 mL·min-1;进样量1 μL,理论板数按欧前胡素和异欧前胡素峰计算不低于3 000。

表1 水-甲醇梯度洗脱表Tab.1 Procedure of gradient elution of water-methanol

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品储备液的制备 精密称取欧前胡素对照品0.01 305 g,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得欧前胡素对照品储备液。精密称取异欧前胡素对照品0.00 596 g,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得异欧前胡素对照品储备液。分别精密吸取上述对照品储备液各5 mL,置50 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得欧前胡素浓度为13.05 μg·mL-1、异欧前胡素浓度为5.96 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密吸取藿香正气口服液1 mL置于10 mL量瓶中,加水稀释并定容至刻度,摇匀,用孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液。

2.3 系统适应性实验 分别精密量取混合对照品溶液和供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进样测定,结果欧前胡素和异欧前胡素峰与其他峰分离良好,无干扰。见图1。

2.4 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液1.00, 2.00,4.00,6.00,8.00,10.00 mL,置10 mL量瓶中,加水定容,摇匀,即得系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件测定,以峰面积(Y)对浓度(X,μg·mL-1)进行线性回归。欧前胡素的回归方程为:Y=13 633X+ 3 976(r=0.999 9);异欧前胡素的回归方程为:Y= 10 661X+1 073(r=0.999 9)。结果表明,欧前胡素浓度在1.305～13.050 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系;异欧前胡素浓度在0.596～5.960 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

A.混合对照品溶液;B.藿香正气口服液;1.欧前胡素;2.异欧前胡素图1 藿香正气口服液和对照品溶液UPLC色谱图A.mix standards solution;B.huoχiang zhengqi oral liquid;1. imperatorin;2.isoimperatorinFig.1 UPLC chromatogram of huoxiang zhengqi oral liquid and mix standards solution

2.5 精密度实验 取批号为11071571藿香正气口服液,按供试品配制方法配制样品溶液,按“2.1”项下方法连续进样6次,测定峰面积。结果欧前胡素和异欧前胡素的RSD分别为0.31%和0.42%。符合精密度实验要求。

2.6 稳定性实验 取批号为11071571藿香正气口服液,按供试品溶液配制方法配制样品溶液,室温下放置0,1,2,4,6,8 h,按“2.1”项下色谱条件分别进样1 μL测定峰面积。结果峰面积基本不变,欧前胡素和异欧前胡素的RSD分别为0.36%和0.48%,表明溶液在8 h内基本稳定。

2.7 重复性实验 取批号为11071571藿香正气口服液,按供试品配制方法平行配制6份,按“2.1”项下方法进样分析,按外标法以峰面积计算含量,欧前胡素和异欧前胡素的平均含量分别为12.00 μg·mL-1和5.16 μg·mL-1,RSD分别为0.36%和0.43%。

2.8 加样回收实验 精密称取18份已知含量的同一批号藿香正气口服液0.5 mL(欧前胡素含量12.00 μg·mL-1,异欧前胡素含量5.16 μg·mL-1)于10 mL量瓶中,分别精密加入相当于制剂中欧前胡素和异欧前胡素含量的80%,100%和120%的欧前胡素和异欧前胡素对照品,按供试品溶液制备下方法制备溶液,按“2.1”项下色谱条件进样1 μL,按外标法计算回收率。结果欧前胡素平均回收率99.25%,RSD= 0.74%(n=9),异欧前胡素的平均回收率98.94%, RSD=0.63%(n=9)。见表2。

2.9 含量测定 3批样品按供试品溶液配制方法配制,按“2.1”项下色谱条件进样分析,按外标法以峰面积计算含量,欧前胡素和异欧前胡素的测定结果见表3。

表3 藿香正气口服液中欧前胡素和异欧前胡素含量测定Tab.3 Contentdeterminationofimperatorinand isoimperatorin in huoxiang zhengqi oral liquid n=3

3 讨论

3.1 检测波长的选择 通过测定欧前胡素的紫外吸收光谱可知:欧前胡素在260 nm以下有强吸收, 302 nm波长处有较大吸收,《中华人民共和国药典》及文献中选用302 nm作为检测波长的较多,但也有选择248 nm作为测定波长[9-10],本实验曾选用双通道进行测定筛选,发现在248 nm比在302 nm吸收更强,且流动相在此波长处对吸收峰也无干扰,故选择248 nm进行测定。

3.2 流动相的选择 关于HPLC法测定欧前胡素和异欧前胡素含量的文献报道中有多种流动相[7,11]。笔者在本实验曾比较乙腈-水和甲醇-水分离系统,结果发现以甲醇-水(55∶45)可达到良好的分离效果,欧前胡素在4.1 min出峰,异欧前胡素在6.7 min出峰,峰形对称,分离效果和柱效都比HPLC法更为好,且分析速度快。但考虑到中成药的多组分,避免样品间的相互干扰,同时要保护色谱柱,本实验在两组分出峰后采取了梯度洗脱,以保证实验结果的准确性。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:1231.

[2] 张海江,郭怀忠,杨晓萍,等.固相萃取-高效液相色谱法测定藿香正气口服液中厚朴酚与和厚朴酚的含量[J].药物分析杂志,2009,29(2):316-319.

[3] 刘永刚,卢建秋,刘珍清,等.高效液相色谱法测定藿香正气水中橙皮苷等4种成分的含量[J].时珍国医国药, 2006,17(10):1947-1948.

[4] 陈雨,张经硕,陈泽琴,等.用高效液相色谱法同时测定藿香正气口服液中厚朴酚和厚朴酚与橙皮苷的含量[J].中国药物与临床,2006,6(2):105-108.

[5] 刘珍清,刘颖,卢建秋.毛细管气相色谱法测定藿香正气水中百秋李醇的含量[J].中国实验方剂学杂志,2009, 15(12):18-20.

[6] 张丽英,任艳春,仲昭庆,等.白芷中欧前胡素的含量测定[J].中医药信息,2002,19(4):24.

[7] 王洪志,李惠芬,周静,等.HPLC法测定元胡止痛片中欧前胡素和异欧前胡素[J].中草药,2007,38(7): 1018-1019.

[8] 章军,王跃生,李慧,等.HPLC法同时测定元胡止痛分散片中延胡索乙素和欧前胡素的含量[J].中国实验方剂学杂志,2009,15(12):10-12.

[9] 王连国,王欣,孟宪杰.高效液相色谱法测定白芷中欧前胡素和异欧前胡素含量[J].现代中西医结合杂志, 2011,20(22):2816-2817.

[10] 何鸽飞,易爱纯,张顺芝.高效液相色谱法测定清眩片中欧前胡素和异欧前胡素的含量[J].中南药学,2010,8 (1):30-33.

[11] 曲永胜.不同工艺对九味羌活颗粒中欧前胡素及异欧前胡素含量的影响[J].齐鲁药事,2009,28(11):692-694.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.031

Determination of Coumarin in Huoxiang Zhengqi Oral Liquid by UPLC

HE Dan1,YANG Lin2,ZHANG Jing-qing1
(1.College of Pharmacy,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.School of Pharmacy,Chongqing Medical and Pharmaceutical College,Chongqing 401331, China)

ObjectiveTo establish a UPLC method for detecting content of imperatorin and isoimperatorin inhuoχiang zhengqioral liquid.MethodsACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)was used and the mobile phase was methanol and water by gradient elution mode.The column temperature was 30℃,the flow rate was 0.3 mL·min-1and the detection wavelength was 248 nm.ResultsThe linear range of imperatorin was 1.305-13.050 μg·mL-1and the regression equation was as follows:Y=13 633X+3 976(r=0.999 9).The linear range of isoimperatorin was 0.596-5.960 μg·mL-1and the regression equation wasY=10 661X+1 073(r=0.999 9).The average recovery was 99.25%(RSD=0.74%)and 98.94% (RSD=0.63%),respectively.ConclusionThe method is accurate,rapid and reliable,and can be used to determine imperatorin and isoimperatorin inhuoχiang zhengqioral liquid.

Huoχiang zhengqioral liquid;Imperatorin;Isoimperatorin;Chromatography,ultra performance liquid

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)10-1370-03

2013-09-13

2013-11-20

何丹(1977-),女,四川达州人,讲师,在读博士,主要从事药物分析研究。电话:(0)15310985850,E-mail:ildoctor@163.com。

张景勍(1974-),女,重庆人,研究员,博士,主要从事药物制剂研究。电话:(0)13308300303,E-mail:zjqrae01 @163.com。